牛痘疫苗致炎皮提取物间质细响研大鼠骨髓充干胞影机制的究

摘要

本研究包括两部分：
　　 第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定
　　 目的:观察及鉴定体外培养大鼠骨髓间充质干细胞并向成骨方向诱导分化
　　 方法:取健康成年SD大鼠，全骨髓贴壁培养法获取MSCs，通过倒置相差显微镜观察其形态学特征和生长状况，绘制细胞生长曲线；培养第2 代MSCs接种后，实验组加入诱导分化培养液，对照组加入等量完全培养液，待MSCs生长至汇合时，进行碱性磷酸酶染色。
　　 结果:分离培养的细胞在第10～12代以前生长性状稳定，呈成纤维细胞形态贴壁生长，增殖能力强；原代培养3～4d后细胞开始增殖，约7～14d可汇合成片，传代周期约为5～9d；成骨诱导分化后12～16d可出现较多散在的致密圆形矿化结节，碱性磷酸酶染色可呈阳性，对照组则未出现矿化结节，ALP活性较弱甚至无显色。
　　 结论:分离培养的细胞成分较为单一，具有骨髓间充质干细胞特性，可用于下一步药物实验。
　　 第二部分：恩再适对大鼠骨髓间充质干细胞增殖凋亡与成骨分化的影响
　　 目的:探讨恩再适对MSCs增殖凋亡及向成骨细胞分化的可能影响机制。
　　 方法:按不同的药物剂量，将恩再适分为空白对照组、培养液药物终浓度为0.1U/ml(低浓度组)、0.5U/ml(中浓度组)和1.0U/ml(高浓度组)共四组，分别干预培养生长于96孔板中的P3 代MSCs，在第1、3、5、7、9、11d 进行MTT 测定，第2、4、6、8、10、12d 进行碱性磷酸酶活性测定；分别干预培养生长于六孔板中的P3 代MSCs共3d，进行流式DNA周期分析及Annexin V-FITC/PI 双标凋亡分析；分别干预培养生长于六孔板中的P3 代MSCs，在第3、7、12d 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Ⅰ型胶原(α2)链Col-I mRNA、转化生长因子(TGF-β1)mRNA及骨钙素(OC)mRNA表达。
　　 结果:在干预早期(＜1周)恩再适对MSCs的增殖分化均无明显影响，甚至促进其发生凋亡，而在干预后期(＞1周)才可发挥促进MSCs 增殖分化的作用；RT-PCR检测示12d时各浓度药物组骨钙素(OC)mRNA表达均升高(P＜0.01)，而Col-ImRNA、TGF-β1mRNA表达差别则无统计学意义。
　　 结论:在足够药物疗程的基础上，恩再适可促进骨折愈合