应用双砷荧光标记法观察乙肝病毒核心蛋白细胞内转运的实验研究

摘要

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染严重危害人类健康，它是当今世界上引起急性肝功能衰竭、慢性活动性肝炎、肝硬化甚至肝癌等肝脏疾病的重要原因之一。乙肝病毒在分类上归属于嗜肝DNA病毒家族，其核心蛋白（HBV core protein，HBc），不仅构成病毒的蛋白质衣壳，同时也是诊断HBV感染的重要血清学标志。在HBV感染过程中，HBc发挥着多种生物学功能，除了包装病毒前基因组RNA与聚合酶蛋白形成核衣壳外，它还参与调节病毒DNA的复制，病毒颗粒的成熟，核衣壳与包膜蛋白的识别及病毒分泌等过程。尽管研究者们已经获取了较多关于核心蛋白结构与功能的信息，但是有关核心蛋白及核心颗粒在细胞内转运的研究却仍有待深入。
　　 【目的】研究半胱氨酸短肽序列Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys 插入HBV核心蛋白主要免疫显性区c/e1位点附近后对病毒核心蛋白表达及病毒颗粒形成的影响，探讨利用双砷化合物ReAsH标记法示踪核心蛋白在细胞内转运的可行性，为运用此技术在活细胞中观察HBV病毒颗粒的动态转运过程提供实验基础。
　　 【方法】运用PCR及分子克隆技术，在质粒pTHBV1.3的C基因区引入编码半胱氨酸短肽的寡核苷酸序列，将所得质粒命名pTHBV1.3-TC。应用脂质体Lipofectamine2000将pTHBV1.3-TC与pTHBV1.3分别瞬时转染入HepG2细胞株。转染48 h后，Western Blot，免疫荧光检测核心蛋白表达；透射电镜观察HBV病毒颗粒的形成。细胞转染pTHBV1.3-TC36 h后，对细胞进行双砷ReAsH标记，运用Olympus FV-500激光扫描共聚焦显微镜进行荧光淬灭恢复试验(Fluorescence Recovery After Photobleaching，FRAP)以检测核心蛋白在细胞内的转运情况。
　　 【结果】酶切鉴定和DNA测序表明，编码TC嵌合型核心蛋白（tetracysteine-tagged HBV core protein，TC-HBc）的HBV表达载体pTHBV1.3-TC构建成功。将质粒pTHBV1.3和pTHBV1.3-TC分别转染细胞后，Western Blot检测显示野生型和突变型核心蛋白均有表达，且两种蛋白瞬时表达的水平没有明显差别（t=0.157，P=0.88）；免疫荧光检测进一步验证了两种蛋白的表达，但野生型核心蛋白（wild type HBV core protein，WT-HBc）与TC嵌合型核心蛋白相比表现为更为明显的核定位。投射电镜观察，在瞬时转染了pTHBV1.3-TC的细胞胞浆浆及培养上清中均发现40 nm的病毒样颗粒，且上清中还存在20 nm左右的球形颗粒。FRAP结果得到TC-HBc在细胞内移动分数（mobile fraction，Mf）Mf=66.9%。
　　 【结论】半胱氨酸短肽标签（tetracysteine tag，TC tag）在插入HBV核心蛋白免疫显性区域（MIR）c/e1位点附近后，对蛋白的表达及病毒颗粒的组装无显著影响，说明TC序列可在不干扰病毒核心蛋白固有空间结构及功能的前提下插入其中。双砷化合物ReAsH可以透过细胞膜并与暴露于衣壳表面的TC序列特异性结合，其在示踪核心蛋白研究中的成功运用为乙肝病毒颗粒在活细胞中的可视化奠定了实验基础。FRAP实验中，核心蛋白Mf=66.9%，说明核心蛋白在胞浆中的较强的转运能力，这种活跃的转运提示细胞内核心蛋白单体在进行高效的聚集组装。