细胞混合种植法构建TiO2纳米管有序生物透析膜的组织工程研究

摘要

疾病控制与预防中心报道,在美国,肾脏疾病已成为第九大主要死因。尽管传统的肾替代治疗,如血液透析、血液滤过及腹膜透析都能成功用于长期治疗慢性肾衰竭,但仍然有高的死亡率。现有的生物人工肾小管辅助装置(bioartificial renal assist device,RAD)克服了传统透析技术只替代了肾小球的功能,而忽略了肾小管功能的缺陷。体外实验证明该装置能很好地发挥肾小管的功能,被美国食品药品管理局批准进入Ⅰ/Ⅱ期临床实验。但因所采用的透析膜材料为高分子聚合物薄膜,该材料固有的疏水性表面限制了其应用,另外,其孔密度较低,不便于装置的微小化及体内移植。
　　TiO2纳米管阵列由于其优异的生物相容性、亲水性及特殊的管状结构,近年来在生物医学领域引起了广泛关注。本文探索采用排列规整、两端通透及较高孔密度的TiO2纳米管阵列薄膜作为透析膜材料,以克服高分子聚合物薄膜的缺陷。能否将肾脏细胞较好的黏附于TiO2纳米管材料并使其发挥肾脏的生理功能,目前还没有公开的文献报道。本文采用阳极氧化法制备了两端通透的TiO2纳米管阵列,通过控制阳极氧化电压获得了4种不同管径的纳米管材料,将每种材料分别经未退火未光照、未退火光照、退火未光照及退火光照处理,并在其上分别种植肾小管上皮细胞株(LLC-PK1)和血管内皮细胞株(ECV304)。在此基础上详细研究了TiO2纳米管材料的几何形貌参数、晶型结构及光催化活性等对两种细胞的黏附及增殖影响规律。利用荧光显微镜考察了TiO2纳米管阵列有序生物透析膜组织工程构建中细胞-材料之间的相互影响规律,采用MTT方法检测了黏附细胞的活性及增殖;同时使用扫描电镜观察了LLC-PK1细胞及ECV304细胞的生长形态。在获取了各单种细胞最佳的生长条件参数之后,考察了混合细胞之间的相互作用机理,研究了胶原蛋白和动态剪切力对单种细胞及混合细胞的黏附、增殖的影响规律,并对制备的透析膜材料进行了初步的重吸收功能检测。
　　研究结果表明管径为70nm且退火未光照的TiO2纳米管阵列膜最有利于LLC-PK1细胞及ECV304细胞的黏附及增殖;扫描电镜观察显示LLC-PK1细胞在TiO2纳米管上的生长形态多呈鹅卵石样,并延伸出很长的伪足,且细胞表面附着密集的微绒毛;ECV304细胞在纳米管上呈圆形。细胞混合种植能较好地促进各单种细胞的黏附生长,混合细胞的活性要高于两单种细胞;在材料表面包被胶原蛋白能明显改善内皮细胞的黏附、增殖,但对上皮细胞的影响不大;动态剪切应力可明显提高增殖活性,且使细胞分布更均匀,有利于细胞形成单层状;功能检测实验证实两种细胞能在TiO2纳米管阵列上存活,且能发挥肾脏的重吸收功能。这为利用组织工程构建具有复合功能的生物人工肾提供了良好的实验基础。

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1 绪论

1.1 肾脏疾病的现状

1.2 人工肾装置的发展

1.3 组织工程概述

1.4 透析膜材料的选择

1.5 细胞外基质的作用

1.6本课题的研究意义、内容及可行性分析1.6.1 课题来源

2.1引言

2.2 两端通透TiO2纳米管阵列的形成机理及应用

2.3 实验方法

2.4 形貌物相表征

2.5 本章小结

3 肾小管上皮细胞的组织工程构建

3.1 引言

3.2 细胞的购买及培养

3.3 LLC-PK1细胞的组织工程构建

3.4 本章小结

4 内皮细胞的组织工程构建

4.1 引言

4.2 细胞的购买及培养

4.3 ECV304细胞的组织工程构建

4.4 本章小结

5 混合细胞的组织工程构建

5.1 引言

5.2 混合细胞种植的实验方法

5.3 混合细胞种植的生长状态

5.4 混合细胞的黏附及增殖活性

5.5 本章小结

6 胶原蛋白及动态剪切力对细胞组织工程的影响及功能评估

6.1 引言

6.2 胶原蛋白对细胞组织工程的影响

6.3 动态剪切力对细胞组织工程的影响

6.5 本章小结

7 全文总结及展望

7.1 论文创新点

7.2 全文总结和展望

致谢

参考文献

附录 硕士期间的研究成果