一溴二氯甲烷的微核效应及对细胞增生的机制探讨

摘要

一溴二氯甲烷(bromodichloromethane,BDCM)是氯化消毒饮用水中含量最高的一类消毒副产物(disinfectionby-products,DBPs)—三卤甲烷(trihalomethanes,THMs)的一种。除了BDCM,THMs还包括氯仿、二溴一氯甲烷(dibromochloromethane,DBCM)和溴仿。动物实验显示THMs对啮齿类动物结肠、肾脏和肝脏具有致癌作用。其中,两年致癌实验证实BDCM灌胃染毒可诱导F344大鼠大肠肿瘤和肾脏肿瘤及B6C3F1小鼠肾脏肿瘤和肝脏肿瘤。人群流行病学资料表明含THMs的消毒饮用水可增加人群膀胱癌和大肠癌的发病率。然而迄今为止,THMs的致癌机制仍然存在许多未知之处。通常,致癌机制可分为遗传毒性机制和非遗传毒性机制两大类。有研究发现BDCM经谷胱甘肽S转移酶θ-1(glutathioneS-transferase-theta,GSTT1-1)代谢活化后才显示遗传毒性。而BDCM以致癌剂量染毒啮齿类动物可诱导致癌靶脏器异常的脏器毒性、DNA甲基化和细胞增生,提示非遗传毒性机制可能在BDCM的致癌过程中起重要作用。
　　尽管在众多遗传毒性实验中THMs显示了阴性结果,但也有体外实验提示THMs须经代谢活化方具有遗传毒性。而来源于人类的代谢酶完全的肝肿瘤细胞株HepG2是毒理学实验中常用的细胞株,可检出直接致突变物和间接致突变物。胞质分裂阻滞微核法(cytokinesis-blockmicronucleustest,CBMNT)是一套以检测染色体断裂和染色体分离为主的实验体系。因此本研究以HepG2作为受试细胞株,应用CBMNT检测四种THMs的遗传毒性。
　　在遗传毒性研究的基础上,我们选取上述典型溴代THMs—BDCM作为受试物探讨该毒物的非遗传毒性机制。我们利用动物实验重点研究BDCM在不同染毒时间点对雄性F344大鼠不同脏器细胞增生的影响,并探讨E-cadherin介导的细胞黏连和Wnt信号转导通路在BDCM诱导的细胞增生过程中的作用。
　　本研究分为两个部分:
　　第一部分四种THMs对HepG2细胞的诱裂作用
　　目的:探讨四种THMs(氯仿、BDCM、DBCM和溴仿)的诱裂作用。
　　方法:上述四种THMs分别设4个染毒剂量,以苯并(a)芘(benzo(a)pyrene,B(a)P)为阳性对照,二甲基亚砜(dimathylsulfoxide,DMSO)为溶剂对照,应用CBMNT检测四种THMs对HepG2细胞微核率和核分裂指数(nucleidivisionindex,NDI)的影响。
　　结果:与溶剂对照组相比,四种THMs除溴仿外均可使HepG2细胞的微核率显著增加(P<0.01或P<0.05),但诱导微核率显著性增加的有效浓度高达10000μmol/L(氯仿和BDCM)和3000μmol/L(DBCM)。
　　结论:氯仿、BDCM和DBCM可诱导HepG2细胞染色体断裂,具有遗传毒性。
　　第二部分BDCM对雄性F344大鼠不同脏器细胞增生的机制探讨
　　目的:通过E-cadherin介导的细胞黏连和Wnt信号转导通路探讨BDCM对雄性F344大鼠不同脏器(结肠、肾脏和肝脏)细胞增生的机制。
　　方法:将64只雄性F344大鼠随机分为两组,即对照组和BDCM染毒组(100mg/(kgxd))。以BDCM溶于玉米油灌胃染毒动物,每周5天,每天1次。分别于第1、4、8和12周每个时间点每组处死8只大鼠,收集结肠、肾脏和肝脏组织。以苏木精-伊红(hematoxylinandeosin,HE)染色观察大鼠各个脏器的病理变化,实时荧光定量PCR法(real-timePCR,RT-PCR)检测β-catenin,APC,E-cadherin,c-jun,c-myc和cyclinD1mRNA的表达,以亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfitesequencingPCR,BSP)和免疫组织化学法分别检测APC和E-cadherin启动子区甲基化改变和蛋白水平的表达,同时应用增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)免疫组织化学法检测细胞增生的改变。
　　结果:
　　(1)全身性毒性染毒期间大鼠未出现异常死亡,除体重下降以外未观察到与BDCM染毒相关的全身性毒性反应。
　　(2)结肠我们在染毒第1、4、8和12周四个时间点均未观察到大鼠结肠出现与BDCM染毒有关的病理学改变。但是BDCM染毒12周可诱导粘膜上皮细胞E-cadherin启动子区域高甲基化,并降低E-cadherin在mRNA和蛋白水平上的表达。此外,BDCM染毒12周可诱导结肠粘膜上皮异常的细胞增生。
　　(3)肾脏BDCM染毒可引起大鼠轻微的肾毒性,在病理学上表现为在第8和12周皮质近端小管上皮细胞水肿、脂肪变、单个的异形巨核细胞及偶尔可见的上皮细胞脱落坏死。另外,BDCM从第4周起显著性降低肾脏E-cadherinmRNA的水平,从第8周开始引起E-cadherin蛋白在近端小管上皮细胞表达下降。然而与对照组相比,BDCM染毒组E-cadherin基因启动子区甲基化水平在整个实验期间也未显示出有统计学意义的改变。此外,BDCM可在转录水平上显著性增加Wnt通路下游增殖性靶基因c-myc和cyclinD1的表达。与上述结果相一致,BDCM在第4、8和12周均可诱导近端小管上皮细胞异常增生。
　　(4)肝脏
　　BDCM染毒12周可引起部分大鼠肝脏出现肝小叶中心区细胞水肿和脂肪变为主要病变的病理学改变。虽然大鼠肝脏β-catenin和c-mycmRNA在BDCM染毒的第8周显著性降低,但是二者的表达在第12周即恢复至对照组水平。另外,BDCM对肝脏APC和E-cadherin基因启动子区甲基化水平及mRNA和蛋白的表达均无影响。与对照组相比,BDCM染毒组在四个时间点均未显示明显的肝细胞增生。
　　结论:BDCM灌胃染毒可通过抑制E-cadherinmRNA和蛋白的表达来诱导结肠粘膜上皮细胞增生。另外,BDCM通过抑制E-cadherinmRNA和蛋白的表达和在转录水平上激活Wnt通路下游基因c-myc和cyclinD1来引起近端小管上皮细胞异常增生。然而,BDCM未诱导肝细胞明显的非遗传毒性损伤。BDCM在不同脏器可能通过E-cadherin介导的细胞黏连和Wnt通路影响细胞增生。这提示非遗传毒性在BDCM致癌机制中扮演着十分重要的作用。

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前言

第一部分 四种THMs对HepG2细胞的诱裂作用

（一）材料与方法

（二）结果

（三）讨论

第二部分 BDCM对雄性F344大鼠不同脏器细胞增生的机制探讨

（一）材料与方法

（二）结果

（三）讨论

小结

创新点

参考文献

综述

博士研究生期间发表的文章

致谢