镉与汞对人胚肝细胞毒性效应及镉与血清蛋白质的相互作用

摘要

目的:研究镉与汞单独及联合染毒对人胚肝细胞(L02细胞)DNA损伤及凋亡的作用。在此基础上探讨了氯化镉(CdCl2)与牛血清白蛋白(BSA)相互作用机制,以了解CdCl2对蛋白质构象的影响。
　　方法:以不同浓度(0.01~100μmol/L)氯化镉(CdCl2)、氯化汞(HgCl2)及其混合液对L02细胞染毒24h,采用MTT法测定L02细胞的存活率,根据Finney法判断镉与汞对L02细胞的联合作用类型;用单细胞凝胶电泳术(SCGE)和流式细胞术(FCM)检测不同浓度镉与汞单独及联合染毒对L02细胞DNA损伤和细胞凋亡的影响。测定CdCl2-BSA体系在四个不同温度(298,302,306,310K)下的荧光光谱;用Stern-Volmer、Arrhenius、Van’tHoff和小分子与大分子配位方程分别处理荧光光谱实验数据,计算出猝灭常数、活化能、热力学参数及结合常数和结合位点;根据Frster荧光共振能量转移理论计算CdCl2与BSA之间的距离。同时,室温下测定研究体系的紫外吸收光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱和圆二色谱,以探讨CdCl2对BSA结构的影响。
　　结果:0.01μmol/L的镉与汞单独及联合染毒可以刺激细胞的生长,但1μmol/L的镉汞单独及联合染毒可显著抑制细胞的生长;镉与汞等浓度作用于L02细胞后,根据Finney法计算Q=1.4,联合作用表现为相加作用;一定剂量的镉汞单独及联合作用于L02细胞24h后,L02细胞的DNA损伤率和细胞凋亡率均显著高于对照组,且随着染毒剂量的增加,L02细胞的DNA损伤率和细胞凋亡率也呈上升趋势。在四个不同温度(298,302,306,310K)下测得CdCl2与BSA相互作用的猝灭常数分别为27.854、28.527、32.223、33.664Lmol-1,结合常数分别为125.340,58.491,47.808,34.626M-1,活化能为13.24,相应的热力学参数ΔS、ΔH和ΔG分别为-223.364Jmol-1K-1,-78.192KJmol-1,(-11.969,-10.216,-9.838,-9.136KJmol-1)。由Frster理论计算出CdCl2与BSA之间的距离为2.24nm。紫外吸收光谱显示CdCl2加入后,BSA的紫外吸收光谱强度没有发生明显变化;同步荧光光谱结果显示,CdCl2加入后,在△λ=15nm和△λ=60nm时BSA的同步荧光光谱荧光强度均下降,在△λ=60nm时,BSA的同步荧光光谱的荧光强度下降更明显,且最大发射波长有轻微红移;三维荧光光谱显示,加入CdCl2后,BSA峰b的荧光强度有所升高(273.3~282.5),峰1荧光强度略有下降(370.7~368.8),峰2强度显著降低(563.4~540.5);BSA的峰1荧光发射波长有轻微红移,峰2荧光发射波长有轻微蓝移;圆二色谱结果显示随着CdCl2浓度增加,BSA的α螺旋含量先有所增加(从51.93到52.31),后逐渐降低(从52.31到21.39)。
　　结论:镉与汞的联合作用为相加作用,镉与汞单独及联合染毒可引起L02细胞的DNA损伤和细胞凋亡,且存在一定的剂量效应关系。CdCl2对BSA的猝灭过程主要是动态猝灭,CdCl2与BSA之间有较强的结合力。CdCl2与BSA间的作用是一个由焓驱动的自发过程,其相互作用的主要作用力是氢键和范德华力,CdCl2与BSA之间可能通过有效的能量转移而使BSA发生荧光猝灭。同时,CdCl2可影响BSA的微环境和构象。

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引言

第一章 镉与汞对人胚肝细胞DNA损伤和凋亡的影响

1．前言

2．材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3．结果与讨论

3.1 细胞生长实验结果

3.2 细胞DNA损伤测定结果

3.3 细胞凋亡测定结果

3.4 讨论

4．本章小结

参考文献

第二章 氯化镉与牛血清白蛋白相互作用的研究

1. 前言

2 材料与方法

2.2方法

3. 结果与讨论

3.1 CdCl2对BSA荧光强度的影响

3.2 CdCl2对BSA荧光猝灭机理的探讨

3.3 结合常数和结合位点

3.4 CdCl2与BSA之间的相互作用力类型

3.5 BSA与CdCl2之间的能量转移

3.6 CdCl2对BSA结构的影响

4. 本章小结

参考文献

综述

致谢