氨来占诺抑制破骨细胞发生和卵巢切除后骨质丢失及其分子机制的研究

摘要

目的：
　　1.利用小鼠原代破骨前体细胞，研究氨来占诺对体外破骨细胞发生及功能的影响；
　　2.利用小鼠原代破骨前体细胞，进一步研究氨来占诺对体外破骨细胞发生和功能影响的分子机制；
　　3.利用卵巢切除小鼠骨质疏松模型，研究氨来占诺对体内破骨细胞活性的影响，了解氨来占诺是否能抑制卵巢切除小鼠骨质疏松模型的骨丢失。
　　方法：
　　1.取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，分离并培养小鼠原代破骨前体细胞（BMMφ）；采用CCK-8方法检测不同浓度的氨来占诺对BMMφ增殖的影响；采用抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)染色的方法检测氨来占诺对BMMφ向破骨细胞分化的影响；采用FITC-Phalloidin和DAPI染色的方法检测氨来占诺对BMMφ向破骨细胞分化过程中肌动蛋白环结构形成的影响；利用Corning Osteo Assay Surface培养板检测氨来占诺对BMMφ向破骨细胞分化过程中骨吸收的影响；利用Boneslices牛皮质骨片检测氨来占诺对BMMφ分化成熟破骨细胞骨吸收的影响。
　　2.取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，分离并培养小鼠原代破骨前体细胞；采用Western Bloting和化学发光法凝胶电泳迁移率的方法检测氨来占诺对NF-κB激活的影响；采用Western Bloting方法检测氨来占诺对MAPKs信号通路激活的影响；采用Western Bloting方法检测氨来占诺对破骨细胞发生过程中NFATcl/c-Fos蛋白表达的影响；采用实时定量RT-PCR的方法检测氨来占诺对破骨细胞发生过程中破骨细胞标志基因表达的影响。
　　3.取12周龄雌性C57BL/6小鼠，建立卵巢切除小鼠骨质疏松模型。用氨来占诺处理小鼠模型8周，取股骨做相应检测。采用μ-CT扫描的方法检测氨来占诺对体内微结构变化的影响；采用组织形态学分析股骨TRAP染色切片，检测氨来占诺对体内破骨细胞活性的影响。
　　结果：
　　1.氨来占诺以一种剂量依赖性的方式抑制破骨细胞发生和破骨细胞发生过程中的骨吸收；氨来占诺在早期抑制BMMφ向破骨细胞的分化；氨来占诺在(0,1.5,3,6,12,25μM)浓度时，对BMMφ的增殖没有明显的抑制作用；氨来占诺抑制了BMMφ向破骨细胞分化过程中肌动蛋白环结构的形成；氨来占诺抑制了BMMφ分化成熟破骨细胞的骨吸收；
　　2.氨来占诺抑制RANKL诱导的NF-κB/p-65、ERK、JNK的磷酸化；抑制了破骨细胞发生过程中c-Fos和 NFATc1蛋白的表达；减少了破骨细胞标志基因，包括抗TRAP、MMP-9、组织蛋白酶K和NFATc1的表达；
　　3.在卵巢切除小鼠骨质疏松模型，氨来占诺通过抑制破骨细胞的活性防治骨质丢失。
　　结论：氨来占诺通过抑制RANKL-RANK信号通路的多个下游通路，包括NF-κB/p-65、ERK、JNK、c-Fos/NFATc1，抑制体外破骨细胞的发生和骨吸收，防治卵巢切除后的骨质丢失。我们的研究证明：氨来占诺可被认为是一个治疗破骨细胞相关疾病的新药，尤其是绝经后骨质疏松。

目录

声明

前言

第一部分 氨来占诺抑制体外破骨细胞发生和功能的研究

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分 氨来占诺抑制体外破骨细胞发生分子机制的研究

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第三部分 氨来占诺抑制卵巢切除动物模型的骨质丢失

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

综述:RANKL-RANK信号通路在破骨细胞发生方面的相关研究

附录一：英文缩写词表

附录二：攻读博士学位期间发表的论文以及参与的课题

致谢