MiR-17-5p调控非创伤性股骨头坏死骨髓基质干细胞成骨分化与增殖的相关研究

摘要

第一部分主要miRNA在非创伤性股骨头坏死患者和对照组患者骨髓基质干细胞中的表达差异研究
　　目的:观察非创伤性股骨头坏死患者与骨性关节炎患者骨髓基质干细胞中主要miRNA的表达差异，寻找在非创伤性股骨头坏死发病过程中起重要调节作用的miRNA。
　　方法:大量查阅文献后找到参与调节骨髓基质干细胞成骨分化，成脂分化，增殖相关过程的主要备选miRNA10个，分别为：miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，miR-96-5p，miR-124-3p，miR-125b-5p，miR-133a，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p。临床上收集了20例非创伤性股骨头坏死患者原代骨髓基质干细胞以及10例对照组患者原代骨髓基质干细胞，使用实时荧光定量RT-PCR方法检测上述10个miRNA的在实验组及对照组中的表达。
　　结果:miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，miR-125b-5p，miR-133a，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p在实验组表达较对照组显著降低，有统计学意义（p<0.05），miR-96-5p，miR-124-3p在对照组和实验组间无明显差异(p>0.05)。
　　结论:miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，miR-125b-5p，miR-133a，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p可能通过靶向于不同的mRNA调节骨髓基质干细胞的分化与增殖，在非创伤性股骨头坏死病理过程中起作用。
　　第二部分miR-17-5p调控SMAD7在HMSC-bm成骨分化过程中表达的研究
　　目的：miR-17-5p在非创伤性股骨头坏死患者MSC中表达水平显著低于对照组，本部分实验目的在于通过生物信息学预测与荧光素酶报告基因检测找到并确定miR-17-5p的靶基因，并检测其在非创伤性股骨头坏死患者MSC标本中的表达水平以及在HMSC-bm成骨分化过程中的表达水平变化规律。
　　方法：使用TargetScan6.2与Pictar网站进行miR-17-5p靶基因预测。实时定量PCR检测第一部分中20个非创伤性股骨头坏死患者MSC标本中SMAD7表达水平，以及其与miR-17-5p表达水平是否具有相关性。实时定量PCR检测BMP-2诱导的HMSC-bm成骨分化过程中第0,1,2,4,6天miR-17-5p及SMAD7表达水平变化趋势（与不加入BMP-2的对照组进行比较）。在HMSC-bm细胞中使用miR-17-5p类似物与miR-17-5p抑制剂调整miR-17-5p表达水平，实时定量PCR检测SMAD7表达水平，Western蛋白印迹试验检测Smad7浓度。采用荧光素酶报告基因检测方法，检测miR-17-5p与SMDA7是否具有调控关系。
　　结果： SMAD7通过生物信息学预测可能是miR-17-5p的靶基因，结合SMAD7的生理作用我们认为miR-17-5p可能通过靶向抑制SMAD7在非创伤性股骨头坏死病理过程中起调控作用。Real-time PCR结果显示在非创伤性股骨头坏死患者MSC标本中miR-17-5p与SMAD7表达水平呈负相关（R2=0.5440，p=0.0002）。在BMP-2诱导的HMSC-bm成骨分化过程中miR-17-5p的表达水平自诱导后第一天起显著高于对照组（p<0.05），SMAD7的表达水平自诱导后第二天起显著低于对照组（p<0.05）。miR-17-5p类似物组SMAD7表达水平与Smad7蛋白浓度显著高于阴性对照组，miR-17-5p抑制剂组SMAD7表达水平与Smad7蛋白浓度显著低于阴性对照组，差异均有统计学意义（p<0.05）。荧光素酶报告基因检测示miR-17-5p通过靶向抑制SMAD7下调其表达。结论： miR-17-5p通过不完全互补结合SMAD7的3’UTR端靶向抑制其表达，在非创伤性股骨头坏死发病过程及MSC成骨分化过程中发挥调控作用。
　　第三部分miR-17-5p促进HMSC-bm细胞增殖及成骨分化的机制研究
　　目的：研究miR-17-5p提高HMSC-bm细胞系增殖与成骨分化的机制。
　　方法：在HMSC-bm细胞中转染miR-17-5p类似物与miR-17-5p抑制剂调整miR-17-5p表达水平并设立阴性对照，转染4小时后加入100ng/ml BMP-2进行成骨诱导。6天后实时定量PCR观察RUNX2以及Ⅰ型胶原表达水平改变，通过ALP染色观察HMSC-bm细胞内碱性磷酸酶表达强度，通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖的改变。为了证明HMSC-bm细胞增殖及成骨分化增强是通过SMAD7表达水平下降而导致的，我们通过转染pcDNA3.1-SMAD7人为提高SMAD7表达水平，观察以上效应是否减弱及逆转。
　　结果：在BMP-2诱导的HMSC-bm成骨分化过程中，转染miR-17-5p类似物组RUNX2，COL1A1的表达水平显著高于阴性对照组（p<0.05），碱性磷酸酶表达显著高于对照组，细胞增殖显著高于对照组（p<0.05）。转染miR-17-5p抑制剂组RUNX2，Ⅰ型胶原的表达水平显著低于阴性对照组（p<0.05），碱性磷酸酶表达显著低于对照组，细胞增殖显著低于对照组（p<0.05）。通过转染pcDNA3.1-SMAD7人为提高SMAD7表达水平后可见以上效应被部分削弱。
　　结论：miR-17-5p可提高HMSC-bm细胞的成骨分化及增殖，这种调控通过靶向抑制SMAD7表达起作用。

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英文缩写对照词表

第一部分主要miRNA在非创伤性股骨头坏死患者和对照组患者骨髓基质干细胞中的表达差异研究

摘要

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前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分miR-17-5p调控SMAD7在HMSC-bm成骨分化过程中表达的研究

摘要

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前言

材料和方法

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讨论

参考文献

第三部分miR-17-5p促进HMSC-bm细胞增殖及成骨分化的机制研究

摘要

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前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述: miRNAs的作用机制以及在成骨分化与骨疾病中的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表论文