内质网应激与心肺复苏后脑损伤的关系及干预研究

摘要

【目的】最近在许多缺血再灌注损伤的研究中都发现，内质网应激在脑损伤的病理生理中起着非常重要的作用，且抑制内质网应激可对脑组织起到一定的保护作用。本研究将SD大鼠作为研究对象，建立心脏骤停及心肺复苏模型，探讨内质网应激与心肺复苏后脑损伤的相关性，并使用内质网应激抑制剂Salubrinal进行干预，初步阐明其可能的作用机制。
　　【方法】：实验一，对SD大鼠采用经皮电刺激心外膜法制备心脏骤停模型并成功进行复苏，分别在造模前和复苏后1小时、3小时、6小时、12小时和24小时处死大鼠，取海马组织进行RT-PCR和western blot实验，分析内质网应激标记物（GRP78和XBP-1）和内质网应激凋亡蛋白(CHOP和caspase12)的表达趋势。实验二，SD大鼠随机分为3组：（1）sham组：仅进行麻醉、经口气管插管和动静脉置管操作；（2） Sal+CPR组：采用经皮电刺激心外膜法制备心脏骤停模型并成功进行心肺复苏，在造模前30分钟，腹腔注射Salubrinal(Sal,1 mg/kg)，（3）DMSO+CPR组：采用经皮电刺激心外膜法制备心脏骤停模型并成功进行心肺复苏，在造模前30分钟，腹腔注射等量的DMSO。心肺复苏后24小时观察各组大鼠生存情况，利用NDS评分系统评价各组大鼠的神经功能情况。随后过量麻醉处死大鼠，取脑组织进行后续研究：①通过透射电镜观察各组大鼠脑组织内质网和线粒体的损伤情况；② TUNEL染色观察各组大鼠海马CA-1区凋亡情况；③免疫组化观察各组海马CA-1内质网应激标记物（GRP78和XBP-1）和内质网应激凋亡蛋白（CHOP和caspase12）的变化；④Western blot方法检查各组大鼠脑皮质eIF2α、p-eIF2α、CHOP和caspase12蛋白的变化情况。⑤提取各组大鼠脑皮质线粒体，化学发光法测定线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pores，mPTP）变化情况；⑥取各组大鼠脑皮质制作单细胞悬液，化学发光法测定细胞内Ca2+浓度变化情况；⑦取各组大鼠脑皮质组织通过试剂盒检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的变化情况。
　　【结果】实验一，心肺复苏后，GRP78、XBP-1、CHOP和caspase12的mRNA和蛋白表达在复苏后持续增加。实验二，①与sham组相比，DMSO+CPR组和Sal+CPR组大鼠在复苏后24小时NDS评分均明显增高（P<0.01），与DMSO+CPR组相比，Sal+CPR组大鼠NDS评分显著降低（P<0.05）；②与sham组相比，DMSO+CPR组和Sal+CPR组大鼠海马CA-1区凋亡的神经细胞明显增多（P<0.01）），与DMSO+CPR组相比，Sal+CPR组凋亡的神经细胞明显减少（P<0.01））；③与sham组相比，DMSO+CPR组和Sal+CPR组大鼠海马内质网均有不同程度的损伤，与DMSO+CPR组相比，Sal+CPR组大鼠海马内质网损伤明显减轻；④与sham组相比，DMSO+CPR组和Sal+CPR组大鼠海马CA-1区GRP78、XBP-1、CHOP和caspase12的表达明显增强，与DMSO+CPR组相比，Sal+CPR组减少了XBP-1、CHOP和caspase12的表达强度，增加了GRP78的表达；⑤与sham组相比，DMSO+CPR组和Sal+CPR组大鼠皮质线粒体均有不同程度的损伤，但是Sal+CPR组大鼠皮质线粒体损伤明显较DMSO+CPR组减轻；⑥与sham组相比，DMSO+CPR组和Sal+CPR组大鼠皮质的p-eIF2α/eIF2α、CHOP和caspase12蛋白表达明显增加（P<0.01），与DMSO+CPR组相比，Sal+CPR组明显减少CHOP和caspase12蛋白的表达（P<0.01），增加p-eIF2α/eIF2α的表达；⑦与sham组相比，DMSO+CPR组和Sal+CPR组大鼠皮质线粒体mPTP明显增加（P<0.01），与DMSO+CPR组相比，Sal+CPR组皮质线粒体mPTP显著下降（P<0.01）；⑧与sham组相比，DMSO+CPR组和Sal+CPR组大鼠脑皮质单细胞悬液中Ca2+浓度均明显上升（P<0.01），与DMSO+CPR组相比，Sal+CPR组大鼠脑皮质单细胞悬液中Ca2+浓度均明显下降（P<0.01）。⑨与sham组相比，DMSO+CPR组和Sal+CPR组的SOD活性下降（P<0.01）；与DMSO+CPR组相比，Sal+CPR组SOD活性增高（P<0.01）。⑩与sham组相比，DMSO+CPR组和Sal+CPR组的MDA活性增加（P<0.01）；与DMSO+CPR组相比，Sal+CPR组MDA活性降低，（P<0.01）【结论】内质网应激参与了心肺复苏后的脑损伤；预先Sal处理可明显改善心肺复苏后24小时神经功能损伤，可能与其抑制过度的内质网应激，减少钙超载，同时抑制氧化应激和保护线粒体功能有关。

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引言

第一部分 内质网应激与心肺复苏后脑损伤的关系

第二部分 抑制内质网应激对心肺复苏后的脑保护作用

第三部分 Sal预处理保护心肺复苏后脑损伤的机制

全文结论

参考文献

综述: 内质网应激与缺血再灌注损伤

附录一攻读学位期间发表论文

致谢