慢性应激诱导的抑郁大鼠空间学习记忆能力障碍及机制

摘要

背景：抑郁是一种常见的神经精神疾病，以持久而显著的心境障碍为主要特征，患者不仅出现情绪紊乱、睡眠障碍、食欲不佳，而且出现包括注意力、学习能力、记忆能力、决策能力、执行能力等方面的认知功能障碍。世界卫生组织最新数据显示，全球约有3.5亿名患者，其中每年自杀死亡人数约100万人，已经成为世界第四大疾病。此外，抑郁也是重要的神经退行性疾病阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，A D)的重要危险因素之一。
　　抑郁由社会、生理、心理等多因素相互作用而导致，其中应激是抑郁发病的重要诱因。神经影像学检测发现抑郁患者前额叶皮层、杏仁核、海马等变小，并随着病程的延长、抑郁的反复发作而更为显著。尸检结果也证实了抑郁患者海马、杏仁核、前额叶皮层等脑区的萎缩。海马是承担空间学习记忆的重要脑区，也参与情绪调节，其在抑郁发病过程中的作用备受关注。而空间学习能显著增加海马神经元数量、提高海马相关的认知能力。抑郁患者下丘脑-垂体-肾上腺轴（Hypothalamic-pituitary-adrenal axis，H P A a x is)功能紊乱明显，并伴有血清糖皮质激素（Glucocorticoid，GC)水平升高。GC是机体重要的一大类应激激素，短期内升高可以帮助机体抵御外界刺激，而持续升高则对机体产生不利影响。海马富含糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor，G R),尸检发现抑郁患者海马中G R的mRNA和蛋白水平均有下降。以上研究提示海马在抑郁病理进程中发挥重要作用，但是抑郁发病中海马损伤的机制仍不清楚，而改善海马功能能否改善抑郁症状等关键科学问题有待深入研究。
　　死亡相关蛋白激酶1(Death-associated protein kinase1，DAPK1)通过不同的途径参与多种脑疾病（如脑卒中、A D)中的神经元损伤：在脑卒中发生过程中，DAPK1激活并诱导神经元凋亡；在 AD发生过程中，DAPK1激活并通过过度磷酸化微管相关蛋白ta u而引起神经元退行性变性。胞外信号调节蛋白激酶/核糖体S6激酶1(Extracellular signal-regulated protein kinase/ribosomal S6 kinase1，ERK/RSK1)是诘抗其损伤的重要信号分子。DAPK1是否参与抑郁发病、海马损伤与DAPK1激活有什么联系，这些问题至今尚无研究报道。
　　目的：研究慢性应激诱导的抑郁大鼠是否出现海马损伤，明确抑郁大鼠海马损伤的机制，研究提高抑郁大鼠海马功能是否能改善抑郁症状。
　　方法：选取3月龄雄性SD大鼠，每天随机给予某一种刺激，包括束缚2小时、夜间照明、禁食24小时、禁水24小时、高温（45℃)、冰水游泳（4℃)、夹尾、足底电击（电流强度0.5 mA)，总共21天。大鼠刺激前后都应用旷场、强迫游泳、糖水偏好实验评价大鼠抑郁程度，并筛选造模成功的抑郁大鼠，然后使用Morris水迷宫实验检测抑郁大鼠空间学习记忆是否受损。使用Bruker小动物磁共振成像仪在体检测应激后大鼠海马体积。采用Nissl染色检测大鼠海马的神经元数量，Golgi染色检测树突棘数量及分类。使用酶联免疫吸附法检测应激后大鼠血清和海马皮质酮水平。通过免疫组织化学染色和免疫印迹技术检测糖皮质激素受体及相关分子在海马的变化。为观察改善海马功能对抑郁行为的影响，我们给予抑郁大鼠7天的水迷宫学习，学习结束后进行抑郁相关行为学及生化、形态学检测。为研究抑郁大鼠海马神经元数量减少的机制，我们通过免疫印迹检测了 GC(10-4 M)处理的N2a细胞、GC(KT4 M)处理的下调DAPK1的N2a细胞、上调DAPK1的N2a细胞中DAPK1、ERK、RSK1活性及凋亡与自噬相关分子的变化。
　　结果：应激后的大鼠在旷场实验中出现自发活动减弱，在强迫游泳实验中静止时间明显延长，在糖水偏好实验中糖水消耗百分比降低31.6％,说明慢性应激能够诱导大鼠抑郁样行为。在 Morris水迷宫实验中，对照大鼠第5、6天寻找平台的潜伏期分别为13.1秒和12.8秒，而且在第7天的检测中首次穿越平台区域的潜伏期为13.2秒、60秒内穿越平台的次数为3.1次。与对照大鼠相比，抑郁大鼠第5、6天大鼠寻找平台的潜伏期显著增加，分别为28.4秒和26.2秒；在第7天的检测中首次穿越平台区域的潜伏期显著增加，为23.8秒；60秒内穿越平台的次数显著减少，为1.7次。在第14天的检测中，抑郁大鼠首次穿越平台区域的潜伏期为36.1秒，显著高于对照大鼠(12.5秒），并且在60秒内穿越平台的次数为1.6次，显著低于对照大鼠（3.9次)。以上数据说明抑郁大鼠不仅短期记忆能力受损，长期记忆能力也同样受损。
　　长时程增强（Long term potentiation,LTP)是学习记忆的功能学基础。本研究中通过刺激内嗅区前穿质纤维(Perforant path，PP)并记录海马齿状回(Dentate gyms，D G)即 P P-D G通路的LTP。抑郁大鼠兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential，ffiP S P)斜率第55-60分钟降低至对照组的67.9%,第85-90分钟降低至对照组的69.4%，说明抑郁大鼠海马LTP的诱导障碍。磁共振成像检测发现抑郁大鼠海马体积比对照组减少18.9%。Nissl染色显示抑郁大鼠海马CA1、CA3、D G区神经元数量比对照大鼠相应区域分别减少18.8%、21.2%、18.9%。G o lg i染色后显示抑郁大鼠海马CA1、CA3、D G区树突棘数量分别减少31.1%、37.1%、41.6%,蘑菇型树突在CA1、CA3、D G区所占比例分别下降46.7%、48.1%、52.4%。以上结果说明抑郁大鼠出现了海马结构与功能障碍。
　　进一步通过ELISA检测发现抑郁大鼠血清和海马组织中皮质酮水平分别升高169.7%、116.5%；免疫印迹检测发现抑郁大鼠海马G R水平减少21.9%、其 Ser211位点磷酸化程度（pS211-GR)减少了30.4%。大鼠脑片免疫组织化学染色显示了 G R、PS211-GR同样的变化趋势。提示G R活性降低。
　　为研究DAPK1在抑郁大鼠海马神经元损伤中的作用及机制，通过免疫印迹检测发现抑郁大鼠海马D A P K1增加193%; E R K总量减少27.3%，E R K磷酸化（p-ERK)水平降低88.2%,提示E R K活性下降;R S K1总量下降37.8%，pS380-RSK下降64.5%,提示R S K1活性下降;含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase3，Caspase3)增加60.8%、Caspase3剪切片段增加193.2%，提不凋亡激活;Beclinl增加52.5%、微管相关蛋白轻链3 II（Microtubule-associated protein light chain3 II，LC3 II)增加45.7%，提示自噬体形成增多。免疫组织化学染色发现抑郁大鼠海马CA1、CA3、D G区DAPK1着色程度变深，海马CA1、CA3、D G区DAPK1分别增加143.7%、72.9%、91.5%,并且DAPK1在神经元内的分布发生改变，由神经元突起转移至神经元胞体中。抑郁大鼠海马C A1、C A3区E R K分别降低18.7%、28.9%；海马CA1、C A3区p-ERK水平分别降低47.6%、38.4%。
　　体外用糖皮质激素（104 M)处理N2a细胞24小时后，与无GC处理的细胞相比，DAPK1增加56.5%、Caspase3总量增加180.3%、Caspase3剪切片段增加119.9%、Beclinl增加192.6%、LC3 II增加50.3%、ERK总量减少40.6%、p-ERK降低68.6%、RSK1总量下降28.2%、pS380-RSK减少68.6%。
　　N2a细胞中转染siDAPKl质粒48小时，GC(10-4 M)处理24小时，与质粒载体对照组比较DAPK1表达降低70.4%、E R K总量增加46.4%、p-ERK增加134.6%、RSK1总量增加119.0%、pS380-RSK增加49.1%、Caspase3总量减少68.9%、Caspase3剪切片段减少68.6%、Beclinl减少77.5%、L C3总量减少26.4%、LC3 II减少49.3%。
　　与转染质粒载体的对照组比较，N2a细胞中过表达DAPK1质粒48小时后,DAPK1表达增加70.4%、E R K总量减少75.5%、p-ERK减少63.7%、R S K1总量减少59.0%、PS380-RSK减少81.5%。以上研究结果提示应激后糖皮质激素水平升高可显著激活DAPK1、进而诱导神经元凋亡、自噬体增加；同时，DAPK1激活抑制了ERK和RSK1活性，减少了 ERK和RSK1对DAPK1诱导凋亡的拮抗作用。
　　为进一步证实海马在抑郁进程中的重要性，我们给予抑郁大鼠7天的水迷宫学习训练，经过7天空间学习的抑郁大鼠在水迷宫中寻找平台的潜伏期显著降低，在旷场试验中5分钟内的穿越的总格子数（水平得分）为66.2,比学习前显著增加；双上肢上抬攀爬箱壁次数（垂直得分）为15.08次，比学习前显著增加；运动总路程为14.37米，比学习前显著增加。强迫游泳实验中，经过空间学习的抑郁大鼠在水中的静止时间由154.3秒缩短为74.8秒，比学习前显著减少。糖水偏好实验中经过空间学习的抑郁大鼠糖水消耗百分比为75.9%,比学习前的46.5%有明显增加，说明其抑郁样的行为有明显改善。而未经过空间学习的抑郁大鼠的上述行为学观察指标无显著变化。
　　Golgi染色研究发现，经过空间学习的抑郁大鼠海马CA1、CA3、D G区树突棘密度分别为4.97/10μm、5.01/10μm、5.12/10μm,比未经过空间学习的抑郁大鼠相应区域的树突棘密度显著增加，其中蘑菇型树突棘所占的比例也分别增加37.0%、38.6%、43.0%。免疫印迹检测发现，与未经过空间学习的抑郁大鼠相比，经过空间学习的抑郁大鼠海马DAPK1水平降低81.4%、ERBC增加36.2%、p-ERK增加42.4%、RSK1增加63.6%、p380-RSK增加73.8%、Caspase3降低126.7%、Caspase3剪切片段降低236.3%、Beclin1降低91.6%、LC3 II降低92.4%。
　　以上结果说明空间学习能显著改善抑郁大鼠的抑郁行为；降低DAPK1的激活、提高ERK和RSK1活性是其中的关键机制。
　　结论：本研究发现慢性应激诱导的抑郁大鼠出现空间学习记忆能力显著减低、海马神经元及树突棘数量减少；应激后皮质酮水平升高、DAPK1激活并诱导凋亡细胞增加可能是其中的关键机制之一；空间学习改善抑郁大鼠的抑郁程度，可能与空间学习抑制DAPK1激活、增强海马ERK和RSK1活性密切相关。以上研究证明了海马在抑郁病理进程中的关键作用。DAPK1激活是否激活自噬、自噬在抑郁发病中的作用等问题有待进一步研究。

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中文摘要

英文摘要

第一部分慢性应激诱导大鼠抑郁样行为及学习记忆障碍

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分慢性应激诱导的抑郁大鼠海马神经元凋亡和自噬増加及机制

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分空间学习改善慢性应激诱导的抑郁大鼠的抑郁样行为

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

创新点

下一步研究计划

综述:抑郁症与海马及认知功能障碍

博士期间参与的其他研究

附录一博士期间发表的文章

附录二博士期间获得的主要奖励

附录三博士期间参加国际学术会议情况

附录四中英文缩略词对照表

致谢