特异性提高小麦胚乳中β-胡萝卜素含量的研究

摘要

类胡萝卜素的含量是小麦营养品质的重要组成部分。虽然不同小麦品种中的类胡萝卜素含量有很大差异，但主要积累的都是不能转化成维生素A的叶黄素和玉米黄质，且含量都比较低。随着对类胡萝卜素生物学功能研究的不断深入，类胡萝卜素越来越受到重视，研究人员希望开发出快速有效的手段来提高植物中的类胡萝卜素含量，特别是主粮作物中的类胡萝卜素含量。由于目前对高等植物中类胡萝卜素合成代谢调控的机制仍知之甚少，它限制了精准的类胡萝卜素代谢工程的应用进程。因此，为深入研究类胡萝卜素合成代谢的调控机制，首先需要克隆和鉴定更多的类胡萝卜素合成途径中的关键合成酶基因，为更加精准的类胡萝卜素代谢工程提供理论支持。有鉴于此，本论文主要从以下两个方面开展研究工作：小麦番茄红素环化酶基因(Lycopeneβ-cyclase,TaLCYB)的克隆及功能鉴定；过表达欧文氏菌八氢番茄红素合成酶基因CrtB结合干扰胡萝卜素羟基化酶基因(β-carotene hydroxylase，HYD)，以期达到特异性地提高小麦胚乳中的β-胡萝卜素含量的目的。
　　(1)番茄红素的环化是类胡萝卜素合成通路中的第一个分支节点，所以LCYB和番茄红素ε环化酶(Lycopeneε-cyclase，LCYE)的活性通常被认为可以决定下游类胡萝卜素的含量和最终比例。本实验室前期在过表达CrtB和欧文氏菌类胡萝卜素脱氢酶基因CrtI提高小麦类胡萝卜素含量的研究中发现，转基因株系中内源合成酶基因LCYB的高表达是β-胡萝卜素积累的关键因素，但到目前为止，还没有发现任何关于小麦中LCYB基因的功能以及其与小麦中类胡萝卜素积累相关的研究报道，因此本研究首先通过电子克隆技术，分离得到了全长TaLCYB基因，通过生物信息学分析和细菌互补实验证明了TaLCYB具有番茄红素环化酶功能。实时荧光定量PCR分析结果表明，TaLCYB基因在不同组织中有不同的表达模式，虽然TaLCYB基因在种子发育后期有较高的表达水平，但是β-胡萝卜素的含量仍然呈现下降趋势。另外发现，TaLCYB基因的表达强烈地受到强光处理的诱导，β-胡萝卜素的含量变化和TaLCYB基因的表达变化相一致。通过基因干扰的技术发现，下调小麦中TaLCYB基因的表达可使β-胡萝卜素和叶黄素的含量下降并伴随着番茄红素的积累，同时其它相关的类胡萝卜素合成酶基因的表达同样发生了不同程度的变化，这一研究结果证明TaLCYB基因在小麦种子β-胡萝卜素合成过程中扮演重要的角色并主要控制了维生素A原的合成，同时决定下游类胡萝卜素产物的流量；这为小麦类胡萝卜素的合成代谢研究提供了新的视角并同时为进一步通过遗传代谢工程提高小麦中的β-胡萝卜素含量提供了新的研究思路，即可通过干扰下游合成酶基因来改变代谢平衡从而得到特定类胡萝卜素的积累。
　　(2)类胡萝卜素的遗传代谢工程是目前一种快速有效提高植物中类胡萝卜含量的方法，但是对于如何特异性提高β-胡萝卜素含量的研究报道仍然较少。通过对发育过程中的种子进行HPLC分析发现β-胡萝卜素的含量伴随着种子的成熟度提高而逐渐减少，这个发现对正在探索如何在成熟小麦种子的胚乳中特异性积累大量β-胡萝卜素的研究提供了非常有意义的参考。因为如果我们可以改变种子中的类胡萝卜素的代谢平衡，便可以特异性的积累β-胡萝卜素。在类胡萝卜素合成代谢过程中，β-胡萝卜素羟基化酶在下游的合成通路中扮演了十分重要的角色，它能将具有维生素A原活性的胡萝卜素转变为失去维生素A原活性的叶黄素。我们在研究TaLCYB基因功能的过程中，发现通过干扰 TaLCYB基因的表达可以降低β-胡萝卜素含量并伴随着其作用底物番茄红素的积累，因此如果我们对β-胡萝卜素进行羟基化作用的酶HYD进行干扰便有可能达到积累β-胡萝卜素的目的。研究发现，通过干扰HYD基因的表达可使β-胡萝卜素的含量相比对照株系中的0.167μg g-1提高10.5倍，达到了1.76μg g-1；过表达CrtB基因为合成通路引入新的底物导致β-胡萝卜素提高了14.6倍达到2.45μg g-1；而过表达CrtB基因结合HYD干扰导致β-胡萝卜素在小麦胚乳中的大量积累，相比野生型Bobwhite提高了31倍达到5.06μg g–1。通过对不同组合的转基因株系进行qRT-PCR分析发现，无论是外源CrtB基因的表达还是HYD基因的干扰都引起不同的内源类胡萝卜素合成酶基因表达的上调，推测不同的转基因策略通过不同的调控机制影响内源类胡萝卜素合成酶基因的表达从而影响类胡萝卜素含量的积累。这一研究结果证明在小麦中可以通过干扰下游合成酶基因来改变代谢平衡从而得到特定类胡萝卜素的积累。并结合过表达CrtB基因得到了到目前为止β-胡萝卜素含量和总类胡萝卜素含量积累最高的小麦转基因株系。
　　本研究通过克隆和鉴定类胡萝卜素合成关键酶基因的功能并探索了进一步通过代谢工程提高小麦中β-胡萝卜素含量的新思路，也为今后创制高β-胡萝卜素含量的转基因小麦新品种奠定了基础。

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1 绪论

1.1 类胡萝卜素简介

1.2 类胡萝卜素的功能

1.3 类胡萝卜素的合成途径

1.4 β-胡萝卜素的功能及研究

1.5 类胡萝卜素的基因工程研究

1.6 小麦的营养品质及其类胡萝卜素研究进展

1.7 本文的研究目的和研究内容

2 TaLCYB的功能研究及RNAi技术在小麦类胡萝卜素基因工程中的应用

2.1 实验材料、仪器及试剂

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 本章小结

3 过表达CrtB结合HYD干扰特异性提高β-胡萝卜素含量

3.1 实验材料、仪器及试剂

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 本章小结

4 全文总结与展望

4.1 主要研究结果

4.2 本文特色与创新

4.3 课题展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间发表的论文

附录2 本论文中使用的质粒图谱