线虫OCR试验优化及评价饮用水消毒副产物毒性的适用性研究

摘要

饮用水中已有超过600种氯化消毒副产物（disinfection by-products，DBPs）被发现，并且新DBPs还在不断被识别。研究发现，很多DBPs具有潜在的健康风险，评估饮用水中DBPs的健康危害对于保障饮用水水质安全具有重大的现实意义。DBPs基本毒性评估常以半数致死浓度（median lethal concentration，LC50）为基本指标，亚致死毒性指标较少使用；而人体对DBPs的暴露呈现低剂量长期暴露的特征，DBPs的亚致死效应构成潜在的主要健康危害风险。氧气消耗率（oxygen consumption rate，OCR）是反映生物体代谢状态的指标，OCR的变化能迅速地反映出毒物对好氧生物的毒性效应，是一个比致死更敏感的亚致死毒性效应指标，以监测生物体OCR为基础的检测技术在快速敏感的筛检化学品的毒性上有巨大潜力。目前，已经成功开发出利用荧光性氧气传感探针结合酶标仪检测OCR的敏感高通量技术（以下统称OCR试验），用斑马鱼、大型蚤、费氏弧菌、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）等作为模式生物，进行化学品毒物评估与水样毒性筛检。因为该方法适配仪器与试剂还在不断优化，其在实验室的应用还存在一些不确定的因素，需要对试验参数和试验条件重新优化方能应用。C. elegans以其个体小、生命周期短、价廉易培养等优势成为研究化学品毒性的经典模式生物，至今已知的大部分毒物均能用其进行毒性评估。Katherine Schouest已利用C. elegans进行OCR试验，以造成染毒C. elegans呼吸速率相对对照组改变50％的浓度为参考值（median effective concentration，EC50）评估了几类经典毒物（重金属离子、芳香族化合物、农药、微囊藻毒素）的毒性；结果显示较之啮齿动物致死率实验，该方法更为灵敏专一，在快速评估化学品的毒性应用上具有极大潜力。迄今，基于C. elegans的OCR试验是否可用于饮用水中DBPs毒性的评估还不清楚。
　　目的：
　　①优化适用于本实验室的线虫OCR试验方法。
　　②以5种已调控DBPs（二氯乙酸（dichloroacetic acid，DCA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、一溴乙酸（monobromoacetic acid，MBA）、二溴乙酸（dibromoacetic acid，DBA）、亚硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine， NDMA））与新发现的二氯苯醌（2,6-dichloro-1,4-benzoquinone，DCBQ）为测试物，与已有资料比较验证C. elegans的OCR试验评估饮水DBPs毒性的适用性和探索DCBQ的毒性，为未来将此方法应用于快速评估饮用水中新发现DBPs的毒性奠定初步基础。
　　方法：
　　①对以C. elegans为模式生物的OCR试验参数（C. elegans数目、虫期与二甲基亚砜（DMSO）浓度）进行优化，评估在不同的参数条件下荧光动态曲线的表现；同时探索计数C. elegans的方法。
　　②测定5种代表性DBPs与新发现的DCBQ对C. elegans的致死毒性。L4期C. elegans用DBPs染毒24 h后计数C. elegans存活率，染毒浓度范围为0-3000μM，DBPs均设计5-7个染毒浓度组，0μM为阳性对照，计算LC50。
　　③应用C. elegans的OCR试验测定5种代表性DBPs与新发现的DCBQ对C. elegans呼吸的影响。C. elegans年轻成虫用DBPs染毒24 h，染毒浓度范围为0-400μM，DBPs均设计5-7个染毒浓度组，0μM为阳性对照，同时每组设计阴性对照与空白对照。应用酶标仪采集荧光动态曲线计算每组每条 C. elegans的OCR作为判断DBPs亚致死毒性强度的指标，确定一个新的EC50为参考值来衡量6种DBPs的亚致死毒性。
　　④比较致死实验、OCR试验结果，对LC50与EC50进行相关性分析；同时比较基于C. elegans的试验结果与文献报道的体外试验研究结果。在上述基础上，评价C. elegans的OCR试验用于饮用水DBPs毒性评估的可行性。
　　结果：
　　①优化实验结果显示：50-75条C. elegans、年轻成虫、0.1%（v/v）DMSO终浓度，是适用当前条件下本实验室OCR试验的最优参数。
　　②5个DBPs对L4期C. elegans的毒性效应呈现明显的剂量-反应关系，随着浓度增大致死毒性增加，24 h的LC50（x±s）分别为：DCBQ：327.81±13.64μM， MBA：770.99±230.19μM，DBA：1217.80±65.41μM，DCA：1430.52±117.29μM， TCA：1716.86±50.31μM，NDMA：LC50>50000μM。致死毒性按LC50大小排序：DCBQ≥MBA>DBA>TCA>DCA>NDMA，DCBQ呈现出比其他几种已调控DBPs更强烈的致死毒性。
　　③OCR试验检测到了DBPs对C. elegans的呼吸抑制效应。随着6种DBPs暴露浓度逐渐增大，呼吸抑制毒性渐大，各个DBPs对年轻成虫期C. elegans的24 h EC50（_x±s）分别为：DCBQ：6.37±0.40μM，MBA：11.82±1.58μM，DBA：23.93±1.53μM，DCA：28.00±4.74μM，TCA：52.00±37.18μM，NDMA：83.13±35.71μM。亚致死呼吸抑制毒性按EC50大小排序：DCBQ≥MBA>DBA>TCA>DCA>ND MA，DCBQ呈现出比其他几种已调控DBPs更强烈的亚致死的呼吸毒性。
　　④呼吸毒性顺序与致死毒性一致， EC50与LC50之间的相关系数R=0.929（P=0.022）；除DCBQ与MBA之间毒性顺序不一致外，其余几种DBPs的致死毒性、亚致死毒性排序与体外试验毒性顺序一致。C. elegans暴露于6种DBPs的24 h EC50均低于致死实验中相应LC5030倍。
　　结论：
　　①建立了适合本实验室的线虫OCR试验方法。
　　②线虫OCR试验可作为饮用水DBPs毒性评价的快速、敏感、高通量工具。
　　③DCBQ呈现出比其他几种已调控DBPs更强烈的致死效应和呼吸抑制效应，其毒性不容忽视。