MicroRNA-451a在扩张型心肌病患者免疫异常中的作用及机制研究

摘要

本文主要从以下几方面展开论述：
　　第一部分：扩张型心肌病患者循环CD4+T细胞免疫活化及与miRNA表达改变的关系
　　目的：既往研究发现扩张型心肌病（DCM）患者循环CD4+T细胞免疫活化异常可能参与DCM的发生发展，但是CD4+T细胞免疫异常的具体机制尚不清楚。本课题旨在研究DCM患者循环CD4+T细胞的免疫活化和增殖与miRNA的关系。
　　方法：收集DCM患者和正常对照各50例，分离外周血单个核细胞（PBMCs），流式细胞技术检测各组PBMCs中CD4+T细胞表面活化标记物CD25、CD69、MHC-II的表达改变。CFSE标记PBMCs后，经anti-CD3/28刺激培养72小时，检测CD4+T细胞的增殖能力。磁珠分选CD4+T细胞，提取经流式细胞术鉴定其纯度合格后的CD4+T细胞总RNA，进行miRNA芯片表达谱及生物信息学分析。
　　结果：（1）与对照组比较，DCM患者循环CD4+T细胞表面早期活化标记物CD25和CD69表达显著增高，而晚期活化标记物MHC-II呈增加趋势，但无统计学意义。经anti-CD3/28刺激后，与对照组相比，DCM患者循环中CD4+T细胞的增殖指数显著增加。（2）流式细胞技术检测磁珠分选外周血CD4+T细胞的纯度>97％，说明磁珠分选方法可靠。（3）筛查DCM患者（5例）和对照组（5例）中的循环CD4+T细胞miRNA表达谱，发现表达差异倍数>2且有统计学差异的miRNA有17条，其中15条miRNA（miR-206、miR-595、miR-297、miR-1180-3p、miR-3148、miR-4701-3p、miR-3064-5p、miR-4793-3p、miR-6785-5p、miR-6796-5p、miR-6807-5p、miR-6847-5p、miR-6849-5p、miR-6856-5p、miR-7844-5p）在DCM患者循环CD4+T细胞中表达升高，2条miRNA（miR-451a、miR-486-3p）在DCM患者循环CD4+T细胞中表达下降。（4）用RT-PCR法验证发现miR-451a在DCM中表达显著降低，与miRNA芯片结果相符合。多重线性回归分析排除了糖尿病、ACEI/ARBs、β受体阻滞剂和洋地黄等因素的干扰。
　　结论：结果显示DCM患者循环中CD4+T细胞表面免疫活化标记物CD25、CD69增多，anti-CD3/28刺激后增殖能力显著增强，提示DCM患者循环CD4+T细胞异常活化。miRNA表达谱分析提示CD4+T细胞miRNA表达谱改变，其中miR-451a的表达显著下调，可能与CD4+T细胞异常免疫活化有关。
　　第二部分：miR-451a靶向Myc调节T细胞活化及增殖
　　目的：在第一部分研究基础上，进一步探讨miR-451a是否能调节DCM患者T细胞的活化和增殖，以及其通过靶向作用于何种基因而发挥调节作用。
　　方法：miR-451a模拟物及抑制剂分别转染Jurkat T细胞后，流式细胞技术检测细胞表面活化标记物CD25和CD69表达改变，酶联免疫吸附试验检测细胞上清中IL-2的分泌，CCK-8法检测细胞增殖改变。生物信息网站预测Myc可能是miR-451a的靶基因。荧光素酶报告基因法检测miR-451a与Myc基因3?-UTR的结合能力。miR-451a模拟物和抑制剂分别转染Jurkat T细胞后，RT-PCR法和western blot法检测miR-451a对Jurkat T细胞中Myc表达的影响。合成转录因子Myc的siRNA，转染Jurkat T细胞，用RT-PCR和western blot检测Myc的表达，并检测Jurkat T细胞的活化和增殖情况改变。磁珠分选DCM患者循环CD4+T细胞，RT-PCR法检测Myc和miR-451a的表达。
　　结果：（1）与miRNA negative contols（NC）组比较，miR-451a模拟物及抑制剂分别导致Jurkat T细胞miR-451a表达显著上调及下调；与此同时，转染miR-451a模拟物的Jurkat T细胞表面活化标记物CD25和CD69表达显著下降，细胞培养上清中IL-2的含量下降，细胞增殖指数减低，而miR-451a抑制剂组CD25和CD69表达显著升高，上清中IL-2的含量增多，细胞增殖指数升高。（2）荧光素酶报告基因实验显示miR-451a能结合Myc基因3?-UTR。miR-451a模拟物和miR-451a抑制剂分别转染Jurkat T细胞，前者显著抑制Myc的mRNA和蛋白表达水平，而后者则显著增加Myc的mRNA和蛋白表达水平。（3）与siRNA NC组比较，siRNA-Myc组Jurkat T细胞中Myc的mRNA和蛋白表达水平显著下降，同时CD25和CD69表达显著下降，上清中IL-2的含量显著下降，细胞增殖指数显著减弱。（4）DCM患者循环CD4+T细胞中Myc基因的表达显著升高，与miR-451a的表达呈显著负相关。
　　结论：miR-451a通过靶向调控Myc基因而调节DCM患者循环CD4+T细胞的免疫活化和增殖，其表达下调可能是DCM患者异常免疫活化的重要机制。

目录

声明

英文缩略词表及中文对照

前言

参考文献

第一部分扩张型心肌病患者循环CD4+T细胞免疫活化及与miRNA表达改变的关系

材料与方法

结果

第二部分miR-451a靶向Myc调节T细胞活化及增殖

材料与方法

结果

讨论

结论与创新

参考文献

综述：MicroRNAs与心力衰竭相关性的研究进展

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