肠上皮细胞分泌的ANXA1与NK细胞对溃疡性结肠炎小鼠的影响及自愈机制研究

摘要

本文主要从以下几方面展开论述：
　　第一部分：肠上皮细胞分泌ANXA1与NK细胞在溃疡性结肠炎小鼠的作用机制研究
　　目的：在UC炎症微环境下，IECs来源ANXA1的表达变化及NK cells向炎症部位募集情况。
　　方法：6-8周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠，采用硫酸葡聚糖钠盐（Dextran sulfate sodium salt，DSS）构建UC模型；收集结肠组织提取mRNA和蛋白，用Real-time PCR和Western blotting检测ANXA1的表达；分离结肠IECs，通过Real-time PCR和Western blotting检测其ANXA1的表达；Western blotting分析IECs来源的EVs中ANXA1的表达；流式分析NK cells在UC模型组的肠固有层单核细胞（MLN）和肠系膜淋巴细胞（LPMCs）中的比例；从UC模型小鼠分离的NK cells用CFSE染色后，通过尾静脉注射到UC模型小鼠体内，取结肠组织，冰冻切片后荧光显微镜观察NK cells的募集情况；Western blotting检测NK cells中ANXA1受体FPR-1的表达。
　　结果：在DSS诱导的UC模型中，ANXA1在结肠组织、IECs、Evs中表达增加；NK cells在UC结肠粘膜有明显的募集；NK cells表达ANXA1的受体FPR-1。
　　结论：IECs在UC环境中会过表达ANXA1，可能是通过包裹在EVs中作用于NK cell。IECs过表达的ANXA1可能是通过FPR-1结合NK cell，而它们之间的交互作用可能进一步影响了UC进程。
　　第二部分：肠上皮细胞分泌的ANXA1与NK细胞NKG2A的交互作用对溃疡性结肠炎小鼠影响及其自愈机制研究
　　目的：ANXA1如何作用于NK cell；二者通过何种机制影响UC；UC自愈的分子机制探索。
　　方法：分别腹腔注射给予UC模型小鼠生理盐水、anti-ASGM1Ab、anti-ANXA1Ab、anti-ASGM1Ab+anti-ANXA1，记录各组小鼠体重和结肠长度变化，HE染色切片后进行病理评分，分离相应的LPMCs，流式检测其中性粒细胞的含量变化；预先分离UC模型鼠的NK cells，IECs及其EVs备用，NK cells分别接受ANXA1、EVs的刺激或与IECs共培养（在培养体系中加入anti-ANXA1Ab或者anti-IgG），Real-time PCR检测各组NK cells中IFN-γ、TNF-α、NKp46、KLRG1、NKG2D和NKG2A的表达，Western blotting检测NKG2A的表达。在给予DSS诱导UC之前，预先尾静脉给予anti-ASGM1Ab3天处理，DSS诱导4天后，分别通过尾静脉过继转移正常NK cells、EVs刺激的NK cells、ANXA1刺激的NK cells、与IECs共培养（在培养体系中加入anti-ANXA1Ab或anti-IgG）的NK cells，记录体重和结肠长度变化，在3天后取结肠进行组织切片和病理评分；在UC模型小鼠中，分别尾静脉给予anti-IgG和anti-NKG2A Ab处理，记录体重和结肠长度变化，并取结肠进行组织切片和病理评分，分离LPMCs，流式检测其中性粒细胞含量，分离肠道固有层的中性粒细胞，Real-time PCR检测其CD69、ROS、IL-6、IL-17A的表达。
　　结果：去除NK cells和阻断ANXA1功能均会加重UC，且伴有中性粒细胞募集NK cells受ANXA1刺激后过继转移给UC模型小鼠炎症减轻；ANXA1促进NK cells NKG2A的表达；抑制NKG2A加剧UC炎症，且促进中性粒细胞募集和活化。
　　结论：确立了IECs及NK cells在UC中的免疫调节机制：IECs以EVs的形式分泌增加的ANXA1促进NK cells的NKG2A高表达，进而调控中性粒细胞功能影响UC进展，这可能参与了UC的自愈机制。

目录

声明

英文缩写词表

研究背景

第一部分 肠上皮细胞分泌ANXA1和NK细胞对溃疡性结肠炎小鼠的作用机制研究

前言

材料与方法

步骤

结果

讨论

参考文献

第二部分 肠上皮细胞分泌的ANXA1与NK细胞NKG2A的交互作用对溃疡性结肠炎小鼠影响及其自愈机制研究

前言

实验方法及步骤

实验结果

讨论

参考文献

综述：肠道内稳态失衡对炎症性肠病的发病机制的研究进展

附件一 攻读学位期间发表的论文

附件二 攻读学位期间参与科研课题

致谢