西藏高寒植物长鞭红景天(Rhodiola fastigiata)AFLP标记的遗传多样性研究

摘要

长鞭红景天（Rhodiola fastigiata），是一种珍稀的中药材，属于被子植物门（Angiospermae）景天科（Crassulaceae）红景天属（Rhodiola L.）多年生草本，药用有效成份红景天苷和苷元酪醇。因长鞭红景天（Rhodiola fastigiata）生长与分布环境的差异，同一居群与不同居群之间在遗传多样性上呈现一定变化，这些变化和差异是长鞭红景天（Rhodiola fastigiata）不同居群对特定生态环境及其变化的长期适应和进化的结果。 本文以西藏色季拉山的高寒植物长鞭红景天（Rhodiola fastigiata）为材料，选取分布在海拔4300～4700M范围内的长鞭红景天（Rhodiola fastigiata）的3个居群为研究对象，采用AFLP分子标记技术，对长鞭红景天（Rhodiola fastigiata）3个居群的30个个体进行种内遗传多样性分析，并依据扩增条带所得数据进行聚类分析，同时对这30个个体的遗传指标进行相关分析，为更有效地保护和利用这种珍稀药用植物提供理论依据。主要研究结果如下： 1.高质量基因组DNA抽提方法的改进： 通过改良的CTAB 法，成功抽提红景天属植物的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，所提DNA 电泳后呈整齐清晰的一条带，点样孔附近无滞留物质，且没有降解拖尾现象，另经紫外分光光度计检测，OD260/OD280 值均在1.8左右。另本研究中建立的提取高质量基因组DNA方法已成功地应用于其他高寒植物（大花黄牡丹、垫状雪灵芝等）。 2.引物对获取及多态性带： 以形态学差异较大的2份红景天属植物（Rhodiola fastigiata，Rhodiola yunnanensis）为试验材料，从64 对引物中，筛选出4 对多态性较高的AFLP引物组合（E-ACA:M-CAC;E-ACA:M-CAT;E-ACA:M-CAG;E-ACT:M-CTA;）。这4 对引物对西藏色季拉山的高寒植物长鞭红景天的30份供试样品进行了AFLP分析，扩增得到510 条清晰的谱带，其中多态带345 条。 3.简易银染方法的建立： a 固定液（100ml 乙醇+5～10ml 冰醋酸+900ml 去离子水）（12 分钟）；b 银染液（1.5～2ml 甲醛+1.5～2g 硝酸银+1000ml 去离子水）（10～14 分钟）；c1000ml 去离子水水洗15 秒；d显影液（2～3ml 甲醛+15～25gNaOH+1000ml 去离子水）（直到出现清晰条带）；e 用上述“1”液体固定2～3 分钟；f 用1000ml 去离子水洗脱2～3 分钟后，室温下放置胶板。 4.AFLP分析体系的建立： 基因组DNA模板300ng，20ul 酶切与连接体系，酶切与连接一步完成（37℃，5h;8℃,4h；4℃，过夜）；25ul的预扩增体系，酶切与连接处理后的模板DNA 2ul，Taq 酶0.5ul，Pre-ampmix1ul，10×PCR buffer 2.5ul，灭菌双蒸水18.5ul；25ul 选择性扩增体系，预扩增稀释样品2ul，10×PCR buffer 2.5ul，dNTPs 0.5ul，EcoRⅠ引物2ul，Mse Ⅰ引物2ul，Taq 酶0.5ul，灭菌双蒸水17.5ul； 5. 遗传多样性分析指标： 在物种水平上，具有高的遗传多样性。物种水平多态百分率（PPL）为96.61％，Shannon’s信息指数I=0.4893，Nei基因多样性指数H=0.3329；居群水平上，平均多态性百分率（PPL）为64.97％，Nei基因多样性指数H=0.2404，有效等位基因数Ne=1.4252，Shannon’s 信息指数I=0.3545；高寒植物长鞭红景天居群间的遗传分化Gst为0.2779，说明27.79％的遗传变异存在于居群之间，而71.21％的遗传变异存在于居群内，长鞭红景天的居群间的基因流Nm为1.2995。 6.试验结果表明，AFLP分子标记技术可以用于高寒植物长鞭红景天（Rhodiola fastigiata）遗传多样性的研究。