过氧化物酶体增殖物激活受体α对急性肝衰竭的保护作用与机制

摘要

目的:急性肝衰竭是一种由炎症介导的肝细胞损伤过程，预后极差，其器官损伤的免疫学机制尚未完全阐明，寻求新的治疗方法一直是该病研究的热点和难点。过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisomeproliferator-activatedreceptorα，PPARα)是由配体激活的核转录因子，已被证实参与了细胞脂质代谢、凋亡及炎症反应等。尽管多项研究表明PPARα具有明确的抗炎作用，但在炎症作为其主要病生理机制的急性肝衰竭的发生发展过程中，PPARα的作用及机制如何目前国内外尚无研究报道。本研究的目的在于探讨PPARα对急性肝衰竭的保护作用与机制。
　　方法:本实验共分如下两部分。
　　1、动物实验
　　通过D-氨基半乳糖（D-Galactosamine，D-GalN）联合脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）腹腔注射构建小鼠急性肝衰竭模型，检测PPARα在疾病进展过程中的动态表达变化及组织分布情况;给予PPARα的选择性激动剂Wy-14，643干预，观察PPARα对小鼠急性肝衰竭是否具有保护作用;分别用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)及自噬相关基因7的小干扰RNA(smallinterferingRNAagainstautophagyrelatedgene7，siAtg7)抑制细胞自噬，观察自噬受抑后能否逆转PPARα对小鼠急性肝衰竭的原有保护作用，以深入探讨PPARα对D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝衰竭的作用机制。组织病理学分析及血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)活性测定观察肝组织损伤的严重程度;实时定量PCR(RealTime-PCR)检测PPARα、促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)、趋化因子(CXCL-1、CXCL-10)、自噬相关基因(ATG-5、ATG-7、LAMP-1)的mRNA表达;蛋白印迹法(WesternBlot)检测PPARα、炎症信号通路相关蛋白（p-NF-κBp65、p-JNK、p-ERK、p-P38）、自噬相关蛋白（LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1）的蛋白表达。
　　2、原代细胞实验
　　通过LPS刺激小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞(Bonemarrowderivedmacrophage，BMM)制作原代细胞炎症模型，给予Wy-14，643干预，从细胞学水平观察PPARα活化能否诱导细胞自噬，抑制炎症反应;分别用3-MA、siAtg7抑制细胞自噬，观察自噬受抑后能否逆转PPARα的原有抗炎作用，以进一步探讨PPARα对急性肝衰竭发挥保护作用的细胞学机制。向原代巨噬细胞中转染GFP-LC3质粒并于荧光显微镜下观察以检测自噬小体的形成情况;RealTime-PCR检测促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)、趋化因子(CXCL-1、CXCL-10)的mRNA表达;WesternBlot检测自噬相关蛋白(LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1)的表达。
　　结果:
　　1、PPARα在急性肝衰竭时表达受抑，肝组织PPARα的mRNA和蛋白表达水平在急性肝衰竭疾病进展过程中逐渐降低。
　　2、PPARα活化促进了细胞自噬，抑制了急性肝衰竭时的炎症反应，对急性肝衰竭产生保护作用。与急性肝衰竭模型组相比，PPARα的选择性激动剂Wy-14，643干预组小鼠肝大体形态接近于正常的肝脏，肝小叶结构完整，部分肝细胞呈气球样变，小叶内及汇管区炎细胞浸润不明显，血清ALT、AST水平降低，促炎性细胞因子、趋化因子的mRNA及磷酸化的NF-κBp65、ERK、JNK蛋白表达减少;自噬相关基因ATG-5、ATG-7、LAMP-1和蛋白LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1表达增加，且差异具有统计学意义。
　　3、抑制自噬后加重了急性肝衰竭时的肝脏损伤和炎症反应，逆转了PPARα对急性肝衰竭的原有保护作用。分别用3-MA、siAtg7抑制自噬后，小鼠肝呈黝黑色，肝细胞大片状坏死，肝索解离，肝小叶结构无法辨认，汇管区及坏死区可见大量中性粒细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润，血清ALT、AST水平升高，促炎性细胞因子及趋化因子的表达增加，且差异具有统计学意义。
　　4、在原代巨噬细胞炎症模型中，PPARα活化抑制了LPS诱导的炎症反应，而且PPARα的抗炎作用具有剂量依赖性。RealTime-PCR结果显示分别用10μM、25μM、50μM的Wy-14，643干预LPS诱导的原代巨噬细胞炎症模型，观察到促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及趋化因子CXCL-1、CXCL-10的mRNA表达逐渐减少，表明PPARα活化可抑制细胞炎症反应，且PPARα的抗炎作用具有剂量依赖性。
　　5、在原代巨噬细胞炎症模型中，PPARα活化促进了细胞自噬，而且PPARα对自噬的诱导作用具有剂量依赖性。我们分别用10μM、25μM、50μM的Wy-14，643干预已转染入GFP-LC3质粒的原代巨噬细胞并于荧光显微镜下观察，发现随着Wy-14，643干预浓度的增加，原代巨噬细胞内自噬小体的形成逐渐增多;WesternBlot结果显示随着Wy-14，643干预浓度的增加自噬相关蛋白LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1的表达逐渐增多，说明PPARα活化可以诱导细胞自噬，且PPARα对自噬的诱导作用具有剂量依赖性。
　　6、细胞自噬受抑后，逆转了PPARα的原有抗炎作用，加剧了LPS诱导的原代巨噬细胞炎症反应。RealTime-PCR结果显示与单用Wy-14，643激活PPARα相比，在加用3-MA、siAtg7抑制细胞自噬后，原代巨噬细胞中促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及趋化因子CXCL-1、CXCL-10的mRNA表达增加，说明细胞自噬受抑可使PPARα的原有抗炎作用不复存在。
　　结论:
　　1、PPARα在急性肝衰竭的疾病进展过程中表达受抑。
　　2、PPARα活化通过促进细胞自噬减轻肝组织的炎症反应，对急性肝衰竭产生保护作用。
　　3、抑制自噬可加重急性肝衰竭时的肝脏损伤及肝组织的炎症反应，逆转PPARα对急性肝衰竭的原有保护作用。
　　4、PPARα可能成为临床上防治急性肝衰竭的一个新的、重要的靶点。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 PPAR α的mRNA和蛋白在急性肝衰竭的疾病进展过程中表达逐渐减少

2 PPAR α活化对急性肝衰竭产生保护作用

3 PPAR α活化抑制了急性肝衰竭时的炎症反应

4 PPAR α活化促进了细胞自噬

5 抑制自噬后加重了急性肝衰竭时的肝脏损伤，逆转了PPAR α对急性肝衰竭的原有保护作用

6 抑制自噬后加重了急性肝衰竭时的肝脏炎症反应

7 在体外，PPAR α活化抑制了LPS诱导的原代巨噬细胞炎症反应，且呈剂量依赖性

8 在体外，PPAR α活化促进了细胞自噬，且具有剂量依赖性

9 在体外，抑制细胞自噬后加剧了原代巨噬细胞的炎症反应，逆转了PPAR α的原有抗炎作用

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 过氧化物酶体增殖物激活受体对肝衰竭患者肝脏的保护作用与机制

致谢

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