启膈化裁方调控食管癌前病变小鼠分化相关基因NDRG1表达的实验研究

摘要

目的：利用化学致癌剂4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitro-quinoline-1-oxide，4NQO)诱导C57BL/6小鼠食管癌前病变动物模型，观察启膈化裁方对食管癌前病变小鼠分化相关基因NDRG1及c-myc表达的影响，探讨启膈化裁方逆转食管癌前病变的部分作用机制，为临床应用提供实验依据。
　　方法：选取SPF级4周龄C57BL/6小鼠130只，雌雄各65只，体重18±2g。随机分为5组①正常对照组20只：常规饲养；②模型组30只：饮用4NQO水（浓度为100μg/ml）14周，25ml/100g体重/天，造模成功后改饮用水灌胃；③阳性对照组20只：饮用4NQO水14周后，改用全反式维甲酸灌胃；④预防组30只：饮用4NQO水同时，灌服启膈化裁方溶液（含免煎颗粒240mg/ml），14周后只灌服启膈化裁方溶液；⑤治疗组30只：饮用4NQO水14周后，采用启膈化裁方溶液灌胃。每组小鼠每周灌胃3次，每次0.1ml/20g体重，并根据每周小鼠体重变化调整灌胃容积。14周末食管癌前病变模型成功，至24周末，全部处死小鼠，取14、24周末小鼠食管组织行HE染色，光镜下观察正常组、模型组、预防组小鼠食管粘膜上皮的病理改变。24周末透射电镜下观察各组小鼠食管粘膜上皮超微结构的改变；免疫印迹法测定各组小鼠食管粘膜上皮组织NDRG1蛋白的表达；逆转录-聚合酶链反应法测定各组小鼠食管粘膜上皮组织NDRG1、c-myc基因表达。
　　结果：
　　1、各组小鼠一般情况
　　实验过程中，正常对照组小鼠无异常，其余各组小鼠2周内一般情况无异常；2周后，模型组小鼠逐渐出现皮毛凌乱、色枯无泽，颈部毛发脱落，精神不振、卷曲拱背、扎堆，闭目少动，食欲不振，体重下降；14周后，阳性对照组、预防组及治疗组小鼠精神状态和食欲较模型组好；预防组小鼠一般情况好于治疗组。
　　2、各项指标检测结果
　　2.1、光镜下各组小鼠食管粘膜上皮病理形态学变化
　　第14周末和第24周末，正常对照组小鼠食管粘膜鳞状上皮未见异常；第14周末，模型组的小鼠食管粘膜上皮细胞的层数增多，异型细胞累及到食管上皮全层的下2/3，第24周末时，异型增生现象严重，异型细胞大部分累及食管上皮的全层，细胞核染色加深、核仁增大，可见病理性核分裂；第24周末，阳性对照组小鼠食管粘膜上皮增厚，异型细胞介于上皮层的下1/3～2/3之间；第14周末，预防组小鼠食管上皮异型细胞介于上皮层的下1/3～2/3，第24周末时，异型细胞局限于上皮全层的下1/3；第24周末，治疗组小鼠异型细胞大部分局限在上皮层的下2/3，少部分在1/3～2/3之间。
　　2.2、透射电镜下各组小鼠食管上皮细胞超微结构的改变
　　正常对照组小鼠食管粘膜上皮未见异常改变；模型组小鼠食管上皮细胞间隙增宽、桥粒减少、线粒体水肿，部分细胞空泡变性、坏死、上皮脱落，细胞核形态不规则，核周隙增大，核仁变大，可见核切迹，细胞核中染色质边移；与模型组小鼠相比，预防组、阳性对照组和治疗组小鼠的食管上皮病变减轻，细胞间隙变小，桥粒较多；预防组与治疗组相比，细胞间隙较小、桥粒较丰富。
　　2.3、 Western-blotting测定24周末各组小鼠NDRG1蛋白的表达情况
　　与正常对照组相比，模型组小鼠NDRG1蛋白表达水平明显上调，经统计学处理有显著差异（P<0.01）；阳性对照组、预防组、治疗组与模型组相比，NDRG1蛋白表达水平明显下调（P<0.01）；预防组优于阳性对照组和治疗组（P<0.05）。
　　2.4、 RT-PCR法测定各组小鼠NDRG1、c-myc基因表达情况
　　各组总RNA分别等量利用通用引物Olig（dT）15逆转录，用NDRG1、c-myc引物将逆转录产物，进行PCR扩增。分别出现483bp、263bp特异性区带。NDRG1mRNA、c-mycmRNA表达水平分别用 NDRG1、c-myc扩增片断和 GAPDH扩增片断的吸光度比值表示。结果表明，模型组NDRG1mRNA/GAPDHmRNA远远高于正常对照组（P<0.01）；阳性对照组、治疗组、预防组 NDRG1mRNA/GAPDHmRNA明显低于模型组，且有显著差异（P<0.01）；预防组与阳性对照组相比无统计学意义（P>0.05）；预防组与治疗组相比，明显降低（P<0.05）。模型组c-mycmRNA/GAPDHmRNA远高于正常对照组，经统计学处理有显著性差异（P<0.01）；阳性对照组、治疗组、预防组c-mycmRNA/GAPDHmRNA明显低于模型组（P<0.05）；预防组与阳性对照组比较无统计学意义（P>0.05）；预防组与治疗组比较，比值明显降低（P<0.05）。
　　结论：
　　1、食管癌前病变发展过程中，NDRG1蛋白表达及 NDRG1和 c-myc基因表达明显上调；启膈化裁方可降低食管癌前病变小鼠食管组织中NDRG1蛋白表达及NDRG1和c-myc基因的表达，延缓食管癌前病变发展，预防用药有一定优势。
　　2、启膈化裁方延缓食管癌前病变发展，发挥预防和治疗作用的机制可能与调控小鼠食管癌前病变分化相关基因NDRG1及原癌基因c-myc的表达有关。

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前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 实验小鼠一般情况

2 HE染色光镜观察各组小鼠食管上皮组织病理学变化

3 TEM观察各组小鼠24周末食管上皮细胞超微结构的改变

4 WB法测定24周末各组小鼠NDRG1蛋白的表达情况

5 RT-PCR测定各组小鼠食管组织中NDRG1、c-myc基因表达情况

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: 历代医家对食管癌病因病机及治疗思路分析

致谢

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