不同来源C.jejuni经消化道感染致豚鼠周围神经病变率差异的研究

摘要

目的:
　　1、比较不同来源空肠弯曲菌经消化道感染豚鼠致周围神经病变率的差异;2、构建通过自然途径感染豚鼠致周围神经病变的动物模型。
　　方法:
　　1、菌株的选择:选取自GBS患者的粪便标本中分离、培养出的空肠弯曲菌Lulei株、LiChang(LC)株，以比较哪株菌用来构建动物模型更佳;腹泻来源的NCTC11168株，以观察非GBS来源的腹泻菌株是否可致周围神经病变;LuLei变异株为LuLei株经小鼠反复灌胃分离得到的C.jejuni，此菌株在反复小鼠灌胃过程中导致了一只小鼠发生瘫痪，最终死亡，在此实验中进一步观察其致周围神经病变力;Fowl株分离自鸡的粪便，通过此实验观察C.jejuni作为禽类的天然宿主对豚鼠神经的致病性;XiaoTian株为2013年自GBS病人的粪便中分离得到的C.jejuni，同20年前GBS源C.jejuni的致周围神经病变进行比较。
　　2、菌株培养，鉴定及菌悬液的制备:将实验室冻存的以上6株空肠弯曲菌在实验室标准的微需氧条件(42℃，10％CO2、5％O2、85％N2)下培养24小时，传代至第三代后，对其进行革兰染色及马尿酸水解实验鉴定。将鉴定后的菌株制备成空肠弯曲菌菌悬液，浊度为3×109CFU/ml。
　　3、实验动物分组:将SPF级健康的4周龄Hartley豚鼠56只，随机分为6组实验组和1组对照组，实验组根据攻毒菌株不同分为LuLei组、LuLei变异组、LiChang组、XiaoTian组、Fowl组、NCTC11168组和对照组，每组8只。
　　4、攻毒方案:每次灌胃前禁食12小时、禁水3小时。Lulei组、Lulei变异组、LiChang组、Xiaotian组、Fowl组和NCTC11168组每只Hartley豚鼠每次分别灌胃空肠弯曲菌LuLei株、LuLei变异株、LiChang株、XiaoTian株、Fowl株、NCTC11168株3×109CFU/ml的菌悬液1ml，对照组给予灭菌的布氏肉汤1ml，每周连续灌胃三天，灌胃四周，其中每组有两只为灌胃3周，每周连续灌胃3天。
　　5、实验动物观察、解剖取材:自首次灌喂起每天观察实验动物的临床症状并称取体重等。豚鼠瘫痪评分参考Hartley豚鼠EAN模型的瘫痪评分标准[1]:将瘫痪程度分为0～5级，0级:无异常;1级:两后肢脚趾轻微拖拽地面;2级:两后肢脚趾较明显拖地，但未累及其他部位;3级:两后肢显著拖地，常见两后肢偏向同一侧;4级:两后肢完全瘫痪;5级:四肢均受累，甚至呼吸抑制。
　　共灌胃3周的每组2只豚鼠于首次灌胃后第4周解剖，其余豚鼠依次每周每组解剖2只，共分4周解剖完成。取双侧坐骨神经保存于4％多聚甲醛中，后对其进行锇酸染色，观察周围神经病变。对每只豚鼠进行肠道大体观察，有无水肿、出血及坏死等。
　　6、统计分析:每只豚鼠随机分离100根坐骨神经的神经单纤维，于显微镜下观察拍照，记录病变神经纤维数及正常神经纤维计算周围神经病变率(周围神经病变率=病变纤维数/100×100％)。使用SPSS13.0进行x2检验，比较不同组周围神经病变率有无差异。对各组豚鼠的体重变化利用重复测量法，比较各组体重变化有无统计学差异。
　　结果:
　　1、实验动物观察:
　　1.1临床症状:参考豚鼠瘫痪评分标准:各组评分均为0级。Fowl组有2只豚鼠在攻毒后有小片毛发稀疏;NCTC11168组有3只发生脱毛，一只肠脱垂死亡;LiChang组两只脱毛，其中一只翻身反应差，2天恢复;Lulei变异组有两只发生脱毛。其他豚鼠在观察期间无腹泻，瘫痪及脱毛等明显临床表现。
　　1.2体重变化:利用重复测量的方法对各组豚鼠体重进行比较，双侧性检验，得出各组之间体重变化差异无统计学意义。
　　1.3肠道大体观察:在首次攻毒后第27天即末次攻毒后第4天NCTC11168组6号豚鼠发生肠脱垂，其他实验动物胃肠道大体观察无明显异常。
　　2、锇酸染色周围神经病理表现
　　对照组豚鼠坐骨神经可见:髓鞘完整光滑、郎飞氏结正常;
　　实验组豚鼠坐骨神经主要病变表现为:结旁区髓鞘皱缩呈齿状或长城样、髓鞘脱失聚集成片状或卵圆状、神经纤维粗细不均、郎飞氏结延长改变、神经纤维有虫蚀样缺损、整条纤维皱缩等。
　　3、周围神经病变率结果统计:
　　采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，对锇酸染色所见的各组豚鼠坐骨神经的病变数进行x2检验。双侧性检验，检验水准取α=0.05。得出各组间发病率不全相等。为进一步进行比较两组间的差别，采用x2分割法，并对检验水准进行校正。得出各实验组同对照组比较差异均有统计学意义。各组周围神经病变率从高到低依次为:Lulei组(32％)＞Fowl组(21.88％)＞Lulei变异组(20.88％)＞LiChang组(19.75％)＞Xiaotian组(17.38％)＞NCTC11168组(15.63％)＞对照组(4.38％); Lulei组同各实验组比较差异均有统计学意义，且病变率高于其他各组;NCTC11168组与Lulei组、Fowl组比较有统计学差异，病变率低于此两组;NCTC11168组与Lulei变异组、LiChang组、Xiaotian组比较无统计学差异。
　　结论:
　　1、本实验中GBS源的Lulei株、LiChang株、Xiaotian株，来源于鸡的Fowl株，腹泻来源的NCTC11168及GBS源不同生长状态的Lulei变异株空肠弯曲菌可导致豚鼠均发生周围神经病变，但每只豚鼠周围神经纤维的病变率不同，以AMAN型GBS来源的Lulei株所致的周围神经病变率最高，NCTC11168所致周围神经病变率最低。
　　2、以往未注意到有诱发周围神经病变的典型腹泻来源的NCTC11168株也发现了周围神经纤维的病变。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 空肠弯曲菌相关吉兰-巴雷综合征的研究进展

致谢

个人简历