莪术醇联合奥沙利铂对裸鼠胃癌移植瘤生长及BcL-2和Caspase-3表达影响的研究

摘要

目的:我国是一个胃癌大国，在我国胃癌具有的发病率高、早期检出率低、死亡率高的特点，严重威胁着我国人民的生命和健康。目前，手术虽是目前胃癌的主要治疗手段，但是对于进展期胃癌患者化疗更是术后综合治疗中的重中之重。不过化疗药物作用的效果是有限的，并且毒副作用较大，因此寻找新的药物用于胃癌治疗意义显得较为重要。中医药联合化疗药物治疗胃癌术后，在提高生存质量、延长生存期、提高免疫功能、减轻骨髓抑制等方面均优于单纯化疗。莪术醇，又名姜黄环奥醇，为具有半缩酮的氢化奥类化合物，是中药莪术的提取物莪术挥发油中莪二酮在加热或路易斯酸的催化作用下异构而成。目前研究发现莪术醇对于宫颈癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、肝癌等多种癌症具有明显的治疗作用，并且其抗菌抗病毒、抗肝肺纤维化、活血化瘀等也均有明显的效应，是一种对临床疾病具有良好前景的药物。但关于莪术醇治疗胃癌的研究大部分尚集中在体外研究上，体内抗肿瘤的研究相对罕见，且其机制尚未十分明确。本研究拟观察莪术醇联合奥沙利铂对人胃癌细胞(BGC-823)裸鼠皮下移植瘤生长及Bcl-2和Caspase-3表达的影响，并初步探索其作用机制。
　　方法:
　　1、建立人胃癌BGC-823细胞裸鼠皮下移植瘤模型。选取4-5周龄的BALB/c雄性裸鼠2只，在SPF级环境下饲养。取处于对数生长期的人胃癌BGC-823细胞（3.0106个/ml）0.2ml注射于右侧腋部皮下，待瘤体长出后每2天测量皮下瘤长短径，在皮下瘤体直径约1.0cm时取出，剪成大小约1 mm3的瘤块分别种植于20只4-5周龄的BALB/c雄性裸鼠的右侧腋部皮下，同样等瘤体长出后每2天测量皮下瘤长短径，在皮下瘤体直径均约1.0cm时表明建立胃癌BGC-823细胞裸鼠皮下移植瘤模型成功。
　　2、实验分组及药物干预。将20只荷瘤裸鼠随机分为阴性对照组(n=5)、莪术醇（100mg/kg; n=5）治疗组、奥沙利铂（30mg/kg; n=5）治疗组，莪术醇联合奥沙利铂(莪术醇100mg/kg，奥沙利铂30mg/kg;n=5)治疗组。对照组给同量的生理盐水。将药分成4次给药，每4天给一次药、称量一次体重、测量一次瘤体长短径。观察17天后处死荷瘤裸鼠，取瘤体。根据后续实验要求，分别存放。
　　3、结果处理及分析。计算肿瘤体积并绘制肿瘤体积生长曲线，称量瘤重、计算抑瘤率。采用MTT比色法探究肿瘤细胞的生长情况。采用免疫组化、荧光定量RT-PCR法检测各组的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell leukermia/lymphoma-2，Bcl-2)的蛋白表达和mRNA的情况，并计算差异。实验数据应用SPSS21.0软件对各组数据进行统计分析。计量资料结果以均数±标准差（(X)±S）表示，多组样本间均数差异比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，计数资料采用X2检验，检验水准α=0.05。
　　结果:
　　1、荷瘤裸鼠移植瘤的生长曲线及体积变化
　　给药前各组裸鼠肿瘤体积差异无统计学意义(P＞0.05)。从用药的第一天开始，每4天测量一次肿瘤体积。第17天莪术醇组、奥沙利铂组、联合用药组的平均体积低于对照组肿瘤的平均体积，肿瘤平均体积差异具有统计学意义(P＜0.05）。莪术醇组的平均体积高于奥沙利铂组的平均体积，差异有统计学意义（P＜0.05）;莪术醇组、奥沙利铂组平均体积高于联合用药组平均体积，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　2、荷瘤裸鼠移植瘤的瘤重、肿瘤抑制率
　　第17天经颈椎脱臼处死荷瘤裸鼠，完整剖离瘤体，称量瘤重，并计算肿瘤抑制率，用SPSS21.0计算后，莪术醇组、奥沙利铂组、联合用药组瘤重低于与对照组肿瘤瘤重，肿瘤重量差异具有统计学意义(P＜0.05)。莪术醇组与奥沙利铂组差异无统计学意义(P＞0.05)。莪术醇组、奥沙利铂组平均瘤重高于联合用药组平均瘤重，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3、莪术醇联合奥沙利铂对裸鼠移植瘤细胞的生长影响
　　对荷瘤裸鼠移植瘤单细胞培养液进行MTT比色法测定其生长状态，结果发现光密度OD值与对照组相比，24h、48h、72h莪术醇组、奥沙利铂组和联合用药组OD值均低于对照组OD值，差异有明显的统计学意义(P＜0.05)。并计算细胞存活率。24h、48h、72h莪术醇组、奥沙利铂组和联合用药组的细胞存活率均低于对照组细胞存活率(P＜0.05);24h联合用药组的细胞生长抑制与单独应用奥沙利铂组未见明显有效(P＞0.05)但优于单独应用莪术醇(P＜0.05)。48h、72h联合用药组的细胞生长抑制作用更优于单药组(P＜0.05)。
　　4、荷瘤裸鼠肿瘤Bcl-2、Caspass-3的mRNA表达水平的改变
　　与对照组相比，莪术组、奥沙利铂组、联合用药组Caspase-3mRNA表达均显著升高(P＜0.01)，Bcl-2 mRNA表达均显著下降(P＜0.01)，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　5、荷瘤裸鼠肿瘤Bcl-2、Caspass-3蛋白表达水平的改变
　　免疫组织化学染色中，Bcl-2以细胞质或胞膜呈棕黄色颗粒为阳性，Caspase-3免疫组化染色阳性细胞呈胞浆内棕黄色颗粒。结果显示Bcl-2在对照组、莪术组、奥沙利铂组、联合用药组中的表达强阳性率分别为86.67％、23.33％、25.00％、13.33％;Caspase-3在对照组、莪术组、奥沙利铂组、联合用药组中的表达强阳性率分别为26.67％、66.67％、86.67％、93.33％。Bcl-2在莪术组、奥沙利铂组、联合用药组中表达低于对照组，Caspase-3在莪术组、奥沙利铂组、联合用药组中表达高于对照组，其差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1、莪术醇组、奥沙利铂组及莪术醇联合奥沙利铂组对胃癌裸鼠移植瘤生长均具有抑制作用。其中莪术醇联合奥沙利铂相比于单独莪术醇或奥沙利铂的荷瘤裸鼠的皮下移植瘤的体积及重量均低，说明莪术醇和奥沙利铂联合应用可以增强奥沙利铂的抗肿瘤的疗效。
　　2、莪术醇联合奥沙利铂可以增强奥沙利铂对裸鼠胃癌移植瘤细胞的抑制作用。
　　3、莪术醇联合奥沙利铂抑制裸鼠胃癌移植瘤的机制可能是通过上调Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达。

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摘要

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 莪术醇对临床疾病的应用进展

致谢

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