微囊化PC12细胞移植对慢性神经源性疼痛大鼠的镇痛作用及其机制研究

摘要

疼痛是临床康复工作中经常遇到的问题，特别是慢性疼痛和晚期癌痛的治疗更是临床上的难题。目前主要治疗方法包括药物治疗、物理疗法、神经阻滞术等虽在临床上广泛应用，但效果均不明确。目前在临床治疗中最常用的仍是阿片类镇痛药，但此类药物潜在的成瘾性和耐受性是慢性疼痛长期治疗中必须考虑的问题。因此，治疗慢性疼痛迫切需要有效而且安全的方法。 20世纪80年代后期，美国学者提出的细胞移植镇痛方法是慢性疼痛治疗领域的突破性进展。它是将体外培养的异体或自体细胞移植入体内，通过细胞分泌的活性物质来缓解疼痛。目前研究最多和最深入的是嗜铬细胞移植，应用微囊化牛嗜铬细胞蛛网膜下腔移植镇痛的动物实验和临床研究均有报道，但由于肾上腺嗜铬细胞来源匮乏及异种移植存在的伦理学问题，从而限制了该方法的临床应用。最近研究发现，大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)可合成和释放脑啡肽和去甲肾上腺素，为细胞移植镇痛提供了新的细胞来源。 目的: 1.检测传代培养PC12细胞的分泌情况及PENK基因的表达。 2.探讨微囊化对PC12细胞分泌的影响。 3.探讨微囊化PC12细胞移植入慢性神经源性疼痛模型大鼠蛛网膜下腔后的镇痛效果及其机制。 4.探讨移植后的微囊化PC12细胞的致瘤性。 方法: 1.PC12细胞的传代培养及基础分泌功能的检测PC12细胞在DMEM(PH7.4，高糖)+15％胎牛血清中，按1:2传代培养。每个培养皿约含2.5×106个细胞，收集培养液，采用高效液相色谱—电化学检测法检测去甲肾上腺素(NE)的浓度；采用放射免疫法检测甲硫氨酸脑啡肽(M—EK)的浓度。 2.PC12细胞PENK基因的表达采用RT—PCR方法检测PC12细胞PENKmRNA的表达情况。 3.微囊化PC12细胞的制作及分泌情况检测采用海藻酸钠、多聚赖氨酸和海藻酸钠制作APA微囊，并包裹PC12细胞。微囊化PC12细胞在上述培养液中生长，并采用相同方法检测培养液中NE和M—EK的浓度。 4.疼痛模型大鼠制作与蛛网膜下腔微创置管采用Kim模型(L5神经结扎)制作慢性神经源性疼痛模型大鼠；同时，采用PE—50导管插入大鼠的蛛网膜下腔并留置和固定。 5.实验分组及干预采用机械性痛觉过敏试验和斜板试验筛选符合条件的疼痛大鼠。将符合条件的大鼠随机分成三组，微囊化PC12细胞组(APA—PC12组，n=16只)、裸PC12细胞组(n=15只)和空微囊组(n=15只)，分别经蛛网膜下腔置管移植入微囊化PC12细胞1.5×105个、裸PC12细胞1.5×105个和空微囊550-600个。 6.实验结果评测采用冷致痛试验来评估各组大鼠移植前、移植后(每周1次，持续6周)的疼痛行为学变化；同时，检测其脑脊液中NE和M-EK浓度的变化。 7.移植后的微囊化PC12细胞的致瘤性移植术后12周，取微囊化PC12细胞移植组大鼠10只，将大鼠处死，肉眼观察椎管内有无新生物形成；于腰膨大处取脊髓组织切片、染色，光镜下观察标本。 统计学分析: 采用SPSS11.0统计软件包进行统计学分析。计量资料用(均数±标准差)表示。采用重复测量数据的多重比较法和配对t检验。设定显著性水平p<0.05。 结果: 1.传代培养PC12细胞的基础分泌：NE为465.8±78.5pg/ml，M-EK为4.3±0.66pg/ml；PENKmRNA低水平表达。 2.PC12细胞经APA微囊包裹后，培养生长良好，NE和M-EK的分泌情况与微囊化前比较，除微囊化后第1天外，差异无统计学意义(p>0.05)。 3.移植前，三组大鼠在冷致痛试验中两侧后肢收缩次数和时间的差值以及脑脊液中NE和M-EK的浓度比较，三组间差异无显著性(p>0.05)，具有可比性。移植微囊化PC12细胞后，与移植前比较，该组大鼠两侧后肢收缩次数和时间的差值均显著减少(p<0.01)；同时，脑脊液中NE和MEK的水平显著升高(p<0.01)。而在裸PC12细胞组此情况只出现在移植后的2周内，空微囊组在移植前后变化不大(p>0.05)。 4.移植微囊化PC12细胞后的第12周，大体观，10只大鼠椎管腔内均未见新生物形成。脊髓组织病理切片在光镜下观察，显示神经细胞和髓鞘结构完整，无纤维增生和坏死。 结论: 1.传代培养PC12细胞可分泌去甲肾上腺素和脑啡肽，具有PENK基因。 2.APA微囊包裹对PC12细胞的分泌无明显影响。 3.移植至慢性神经源性疼痛模型大鼠蛛网膜下腔的微囊化PC12细胞具有镇痛作用，主要通过分泌的NE和MEK起作用。 4.移植后的微囊化PC12细胞无致瘤性。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

材料与方法

1.材料

2.研究方法

3.统计学分析

结 果

1.PC12细胞的形态和基础分泌功能

2.PC12细胞PENK mRNA的表达

3.微囊化PC12细胞的形态和分泌情况

4.疼痛大鼠蛛网膜下腔移植前后的疼痛行为学变化

5.疼痛大鼠蛛网膜下腔移植前后脑脊液活性成分的变化

6.阻断试验

7.移植后的微囊化PC12细胞的存活情况和致瘤性

讨 论

1.PC12细胞的分泌特性

2.微囊化对PC12细胞分泌的影响

3.微囊化PC12细胞移植的镇痛效果

4.微囊化PC12细胞移植的镇痛机制

5.移植后的微囊化PC12细胞的存活情况和致瘤性

小 结

参考文献

附录:缩略词表

在读期间发表论文情况

致 谢