喷砂酸蚀复合MAO纯钛表面对成骨细胞粘附及基因表达的影响

摘要

种植体表面是影响种植体—结合的主要因素之一。多年来，学者们一直在努力寻找最佳的种植体界面。本课题组在以往的研究中对纯钛表面进行喷砂、酸蚀和微弧氧化（micro arc oxidation，MAO）等技术的复合处理，已经成功研制出一种新型的粗糙表面。通过理化性能分析发现喷砂酸蚀的样品再行MAO，可保留喷砂酸蚀形成的基本表面形态，并可获得均匀连续的复合钙磷的多孔氧化层，形成独特的30×40μm圆形凹陷，表面粗糙度高，表面极性成分增加。 成骨细胞在种植材料表面的附着、粘附和伸展影响后期的生物学行为，如迁移、增殖、分化和矿化等，最终影响骨结合界面的形成。因此成骨细胞在种植材料表面的附着、粘附和伸展是评价生物材料生物相容性的重要指标之一。本课题拟通过建立体外成骨细胞模型并从细胞以及基因水平上初步研究喷砂酸蚀复合MAO纯钛表面对蛋白吸附、成骨细胞粘附、细胞骨架改建和基因表达的影响，以期为研制新型种植体表面提供一定的理论基础，并指导其生物活性的改良。 本课题包括三部分： 第一部分成骨细胞的培养与鉴定 为了获得大量具有成骨活性的成骨细胞，本试验采用胰蛋白酶消化离心法体外分离培养Bal b/c乳鼠颅骨成骨细胞。通过对成骨细胞的纯化、传代，Hayhoe氏偶氮偶联法碱性磷酸酶组织化学染色和矿化诱导后矿化结节Von Kossa法染色进行鉴定，绘制细胞生长曲线。结果表明，本实验培养的成骨细胞与体内成骨细胞的形态和生物学特性相似。经纯化，第3代的成骨细胞生长旺盛，组织形态稳定，可用于研究种植材料生物相容性的体外实验。 第二部分喷砂酸蚀复合MAO纯钛表面对蛋白吸附及成骨细胞粘附的影响 将直径10mm，厚1mm的商业纯钛片用400、600、1000目的SiC砂纸逐级打磨，按表面处理方法的不同分为4组：MAO—SA组为250μm直径Al2O3颗粒喷砂HF酸蚀后MAO处理，MAO组为直接MAO处理，MAO—HT组为MAO处理后水热处理8h，SM组为未处理组。通过将牛血清白蛋白、牛纤维粘连蛋白和成骨细胞分别与样品复合培养，利用Bradford蛋白定量法、扫描电镜（scanning electronic microscope，SEM）和四唑盐比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）观察分析样品在不同时间段对蛋白吸附、成骨细胞形态及附着的影响。结果表明：MAO—HT组在蛋白吸附初期的60min内显著促进FN的吸附，而在90min～180min之间，MAO—SA组对FN吸附的促进作用最为明显。成骨细胞附着在MAO—SA表面2h后已呈现分泌功能的形态，较早的渐趋成熟。MAO—SA和MAO—HT组能促进成骨细胞与材料表面的粘附及增强其粘附结合力，有利于成骨细胞的增殖和分化。 第三部分喷砂酸蚀复合MAO纯钛表面对细胞骨架改建及整合素mRNA表达的影响 将成骨细胞接种于样品2h、4h、24h后，利用激光共聚焦显微镜及免疫荧光的方法对细胞骨架进行形态学观察，采用real—time PCR的方法定量检测成骨细胞整合素亚基αv、β1 mRNA的表达水平。结果表明：接种2h后，MAO—SA和MAO—HT组已经有少量成骨细胞开始铺展。接种4h后，MAO—SA组成骨细胞形态多变，胞内肌动蛋白纤维成束状，有方向性地排列，在细胞周边聚集呈指状突起。MAO—SA钛片表面成骨细胞的肌动蛋白的改建早于其它组，更好地调节细胞形态，促进细胞成熟。体外培养的成骨细胞膜上均能持续表达Itgαv、β1。Itgβ1mRNA表达水平较Itgαv的高。MAO—SA表面能显著地促进成骨细胞Itgαv mRNA的表达，有利于细胞通过与细胞外基质蛋白的结合而与材料发生粘附。MAO—HT对Itgβ1 mRNA表达水平的促进作用呈时间依赖性。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分成骨细胞的培养和鉴定

1材料与仪器

2方法

3结果

4讨论

5参考文献

附图

小结

第二部分喷砂酸蚀复合MAO纯钛表面对蛋白吸附及成骨细胞粘附作用的影响

1材料与仪器

2方法

3结果

4讨论

5参考文献

附图

小结

第三部分喷砂酸蚀复合MAO纯钛表面对成骨细胞的细胞骨架和整合素mRNA表达水平的影响

1材料与仪器

2方法

3结果

4讨论

5参考文献

附图

小结

全文结论

致谢