非小细胞肺癌对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的机制研究

摘要

背景与目的：非小细胞肺癌（Non—small cell lung cancer，NSCLC）位居癌症死亡的首位，在发达国家的5年生存率约15％，发展中国家的5年生存率约9％。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR TKI）是继手术、放疗和化疗之后出现的又一治疗手段。EGFR TKI对部分NSCLC十分有效，但这部分病例最终都会出现继发耐药。明确的耐药机制仍未阐明。本研究为了探讨中国NSCLC人群对EGFR TKI的耐药机制，对EGFR、KRAS、c—MET以及肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）等四个靶点进行研究，分析它们的特点与在耐药中的意义。 材料与方法：以没有TKI治疗过的NSCLC手术后病例作为基线人群，对一组共31例EGFR TKI治疗耐药后的NSCLC进行研究。分别用直接测序法（Direct sequencing）与蝎形探针扩增阻滞突变系统（Scorpions amplification refractory mutation system，ARMS）检测EGFR基因酪氨酸激酶区（18～21外显子）的敏感突变及耐药突变，分析突变与疗效预后的关系；用Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0 Array基因芯片比较3例含T790M突变NSCLC与6例EGFR敏感突变NSCLC之间的全基因组表达变化；用直接测序法与KRAS突变试剂盒（KRAS mutation test kit）检测KRAS基因第12、13、59和61位密码子的突变；用实时荧光定量PCR TaqMan探针法检测c—MET基因的拷贝数；用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测HGF对Gefitinib细胞毒作用的影响；用免疫组化方法检测肝细胞生长因子在耐药后NSCLC中的表达水平。 结果：在耐药病例中直接测序法共检测到48.4％有EGFR敏感突变（15/31）与25.8％有T790M突变（8/31）。ARMS方法检测出85.7％有敏感突变（24/28），51.6％有T790M突变（16/31）。两种方法在EGFR敏感突变检出率上差别有统计学意义（Fisher精确概率法，P=0.0029）；在检测T790M突变时ARMS方法也比直接测序法敏感（卡方检验，P=0.037）。所有T790M突变都在耐药后的标本中检出，其中1例为单独存在的T790M突变。EGFR敏感突变丰度高的病例（仅在直接测序法检测到）对TKI的无进展生存期（Progression free survival，PFS）长于敏感突变丰度低的病例（直接测序未能检出，但被ARMS法检出）（P=0.012）。与高丰度T790M突变的病例相比，低丰度T790M突变的PFS较短（P=0.0028）。 EGFR T790M突变与敏感突变之间的全基因组表达差异主要有细胞凋亡、细胞增殖与肿瘤转移三个方面，包括XAF1、BCL2、BCL2L12、HSP60、HSP10、ADAM9与MET等基因。在没有TKI治疗过的NSCLC病例中KRAS基因突变率为7.6％（10/132），在吸烟人群中突变率高于非吸烟者。在TKI耐药后NSCLC中，直接测序法与ARMS方法均未发现KRAS基因突变。 在基线人群中3.8％（2/53）有c—Met基因扩增；耐药后的NSCLC中16.1％（5/31）有c—Met基因扩增。两组之间差异接近有统计学意义（Fisher精确概率法，P=0.095）。治疗前或治疗后检出的c—Met基因扩增在临床病理因素方面没有明显差异。c—Met基因扩增在EGFR敏感突变或野生型NSCLC中均可出现，有2份耐药后的标本被证实c—Met基因扩增合并EGFR T790M突变。 外源性HGF没有影响Gefitinib对EGFR野生型NSCLC细胞的杀伤作用。17.4％（4/23）耐药后NSCLC为HGF阳性表达。阳性病例均为EGFR19外显子缺失突变NSCLC，其中3例同时合并T790M突变。HGF高表达的病例没有合并c—Met基因扩增。所有HGF阳性病例对TKI耐药后的进一步治疗均无反应。 结论： 1、51.6％（ARMS法）对TKI耐药的中国非小细胞肺癌与继发EGFR T790M突变有关。 2、继发性EGFR T790M突变可能独立于敏感突变而存在。 3、EGFR基因突变丰度不同的NSCLC其无进展生存期不同。 4、EGFR T790M突变引起与细胞凋亡、细胞增殖及转移相关的分子出现变化。 5、中国NSCLC中KRAS基因的突变率为7.6％，与TKI继发耐药无关。 6、16.1％中国NSCLC对EGFR TKI耐药与c—MET基因扩增有关。TKI治疗前出现的c—MET基因扩增与药物诱导出的c—MET基因扩增具有相似的临床病理特点。 7、HGF仅参与EGFR敏感突变NSCLC对TKI的耐药机制，并可以和EGFR T790M突变合并出现。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1肺癌的流行病学

2肺癌的危险因素

3非小细胞肺癌的预后

4 EGFR基因与非小细胞肺癌

5基因组学在肺癌研究中的应用

课题设计

主要仪器及设备

主要试剂

第一部分EGFR基因突变与耐药

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分EGFR耐药突变与敏感突变之间的肺癌基因表达差异

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分KRAS基因突变与耐药

材料和方法

结果

讨论

小结

第四部分HGF/c-MET通路与耐药机制

材料和方法

结果

讨论

小结

结论

创新性与意义

参考文献

附录

在读期间发表的文章与工作

致谢