四价Aβ1-15疫苗比Aβ42疫苗减少Tg2576脑内T细胞浸润

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)最显著的神经病理学特征是神经细胞之间出现大量老年斑(senile plaques，SP)和神经细胞内出现神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)，AD晚期还伴有乙酰胆碱水平降低，胆碱能神经元和胆碱能突触数目减少。AD的分子病理机制虽未完全阐明，但对其中的关键问题有了比较明确的看法，主要表现在：SP主要与β-淀粉样蛋白42(β-amyloidprotein42，Aβ42)的沉积有关；NFT主要与Tau蛋白过度磷酸化有关，Tau蛋白过度磷酸化又与Aβ42的信号通路有关；胆碱能神经元的丢失主要与Aβ40-42的神经毒性有关，载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)和早老基因蛋白(Presenilin，PS)等基因变异使Aβ沉积加速，使AD病理进程加快。因此，Aβ是AD病理的核心因素，以Aβ为靶标的治疗策略也得到广泛认可。
　　 以Aβ为靶标的多种治疗方案主要围绕Aβ的产生、清除和降低毒性几个方面进行设计。免疫治疗是最有前景、最受关注的治疗方法。通过主动免疫或者被动免疫阻止Aβ的聚集或者促进Aβ清除的研究均取得了比较令人满意的实验结果。但是Aβ疫苗AN1792在Ⅱ期临床试验中，有18名出现不同程度的中枢神经系统炎症反应，研究被迫中止。死亡病人的病理研究发现脑内出现了以T淋巴细胞浸润为特点的脑膜脑炎。Aβ疫苗研究虽然出现挫折，但以Aβ为靶标的免疫治疗策略仍然是AD研究中的重点，也仍然最具应用前景。
　　 Aβ本身是一种较弱的自身抗原，Aβ沉积和老年斑在脑内形成一个重要的先天性免疫应答过程，包括在外周产生抗Aβ抗体。Aβ疫苗临床研究中出现的脑膜脑炎现象，可能是因为加剧了先天性免疫应答程度，诱导了大量的T淋巴细胞浸润。AD免疫治疗必须重视对AD脑内免疫状态和T淋巴细胞浸润机制的研究。
　　 AN1792是Aβ42全肽疫苗，其C端含有T细胞抗原表位。AN1792和Th1型免疫佐剂QS21过度激活了Th1型T细胞，引起了脑膜脑炎。因此，接下来的大量研究试图从各方面改良Aβ疫苗，使其在外周免疫过程中尽量减少Th1型T细胞的激活。本课题组前期制备了高滴度的四价Aβ1-15腺病毒疫苗(4×Aβ15)和Aβ42腺病毒疫苗(Aβ42)，均能诱导C57BL/6鼠和Tg2576转基因小鼠产生高滴度Aβ特异性的抗体。和Aβ42疫苗相比，能诱导机体产生向Th2方向极化的免疫反应，从而可能避免出现Th1细胞极化优势的细胞免疫应答所引起的不良反应。4×Aβ15疫苗接种的Tg2576鼠明显改善了认知退化及病理变化，与Aβ42组对比，脑淀粉样沉积斑块面积明显减少。
　　 但是在AD免疫治疗研究中，对T淋巴细胞的浸润机制和T淋巴细胞作用的研究还远远不够。在正常的生理条件下，T淋巴细胞就可能在室周器等部位进入脑脊液或脑实质。在AD的病理情况下，Aβ可能通过其受体RAGE信号通路上调脑血管内皮细胞CCR5的表达，从而促进T淋巴细胞在脑血管内皮细胞上的附着，有利于T淋巴细胞穿越血脑屏障。因此可以推测AD脑内的T淋巴细胞可能远多于正常大脑。在主动免疫的过程中，动员出来的T淋巴细胞又远大于普通的AD病理状态。主动免疫可能导致T淋巴细胞浸润入脑，增加脑膜脑炎风险。因此，4×Aβ15疫苗与Aβ42疫苗相比，能否减少T淋巴细胞的浸润，是关系到疫苗安全性的非常重要的问题。
　　 脑内T细胞浸润是引起脑膜脑炎的主要原因，是不好的一面；但是也可能有好的一面，可能与神经保护作用和神经新生有关。
　　 保护性自身免疫理论认为，适度的轻微的T细胞激活可能对Aβ的清除、认知功能的改善有有利作用；脑内T淋巴细胞的活性状态可以诱导神经新生，从而改善记忆与认知功能。目前，有关保护性自身免疫的理论与实践主要是在实验性脑脊髓炎(EAE)和多发性硬发症(MS)的研究领域中，与AD的病理机制还存在较大的差异。自身抗原T细胞在AD治疗中的作用还仅见于T细胞疫苗格拉默的研究，Aβ疫苗对脑内T细胞的调节作用及对神经发生的影响研究还远远不够，深入研究Aβ疫苗对AD脑免疫状态的影响可能开拓AD研究的新思路。
　　 本实验研究了APP转基因小鼠Tg2576脑内T淋巴细胞浸润的部位和表型，比较四价Aβ1-15腺病毒疫苗(4×Aβ15)和Aβ42腺病毒疫苗(Aβ42)对Tg2576脑内T淋巴细胞浸润的影响，为4×Aβ15疫苗安全性研究打下基础。
　　 材料和方法：
　　 1、分组与取材
　　 Tg2576鼠24只，随机分为4组：AD模型对照组(以下简称Tg2576组)、4×Aβ15组、Aβ42组和GMCSF空载体疫苗对照组(以下简称GMCSF组)，每组6只。同窝同龄的阴性鼠即C57BL/6作为正常对照组(以下简称C57组)。接种采取鼻黏膜接种的方式，每3周免疫一次，一共免疫7个月。19月龄时断头处死，新鲜取脑，每组4只取半侧大脑匀浆提取蛋白质，其余脑组织4％多聚甲醛浸泡固定，常规脱水浸蜡包埋。
　　 2、免疫组化方法
　　 包埋的脑组织从前向后全部连续冠状切片，片厚8μm。实验采用了荧光和可见光两种系统，根据抗体情况作复杂的组合染色。荧光染料采用Alexa Fluor405显蓝色、PI或Alexa Fluor647显红色和异硫氰酸荧光素显绿色的组合，用不同种属来源、不同荧光标记的二抗与一抗结合，直接用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察分析。可见光分析分别用不同种属来源、不同蛋白酶标记的二抗与一抗结合，然后根据标记的蛋白酶分别用DAB(显棕色)、BCIP/NBT(显深紫色)和AEC(显深红色)作不同的组合显色，用可见光显微镜观察分析。
　　 实验首先用TCR-FITC作T淋巴细胞筛选，确认TCR阳性细胞，然后用CD4-Alexa Fluor405、CD8a-Alexa Fluor647作免疫组化区分TCR阳性细胞表型，按分组计数所有TCR、CD4、CD8a、CD25阳性细胞数。分部位选取观察到有TCR阳性细胞的切片作Aβ和CD11b组合染色，观察TCR阳性细胞、老年斑和CD11b阳性的活化小胶质细胞之间的位置关系。
　　 3、Western blot方法
　　 匀浆提取的蛋白质采用Western blot方法检测脑内炎症因子IFN-γ、IL-4和TGF-β1及其下游Smads、STATs的表达；检测神经营养因子BDNF、NGF及其高亲和力受体TrkA和低亲和力受体p75的表达；检测相关生长因子IGF-1、EGF、VEGF等的表达。
　　 结论：
　　 1、4×Aβ15疫苗比Aβ42疫苗减少Tg2576脑内的TCR阳性细胞浸润。
　　 2、4×Aβ15疫苗比Aβ42疫苗上调p75表达可能对AD脑的自我修复和炎症反应有更为重要的意义。
　　 T淋巴细胞能分泌IFN-γ、IL-4、TGF-β1等炎症因子，影响脑的炎症状态，激活小胶质细胞等的炎症反应；也能分泌神经营养因子BDNF、VEGF、IGF-1和NGF，影响神经细胞的存活和神经新生。4×Aβ15和Aβ42腺病毒疫苗对外周T淋巴细胞的激活作用不同，对AD脑内的T淋巴细胞浸润的影响也不同。4×Aβ15疫苗能有效减少T淋巴细胞在AD脑内的浸润，一方面降低了脑膜脑炎的风险，提高了Aβ疫苗的安全性；另一方面抑制分泌IFN-γ、TGF-β1、IL-4等炎症因子，通过神经营养因子和其受体如TrkA、p75NTR等促进神经新生，修复受损的神经元，重建脑功能，甚至改善认知功能。
　　 研究还发现，TCR阳性细胞尤其是在中脑黑质网状部和纹状体部较为集中。中脑黑质网状部和纹状体部是帕金森病的主要病理部位，但既不是SP聚集的部位，与Aβ特异性关系不密切，也不是血管最丰富的部位，对此现象尚无其他研究报道引证，也暂时没有其他解释。我们推测，TCR阳性细胞的聚集可能与特异性脑区神经组织细胞分泌的趋向性因子有关，对特定脑区退行性变疾病和炎症性疾病的研究有重要的导向性意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

1.Aβ是AD病理的核心因素

2.脑与免疫反应

3.AD免疫治疗中存在的问题

4.本课题的目的和意义

第一章 四价Aβ1-15疫苗与Aβ42疫苗对Tg2576脑内T细胞浸润的影响

1.材料和方法

2.结果

第二章 四价Aβ1-15疫苗与Aβ42疫苗对Tg2576脑细胞因子的影响

1.材料和方法

2.结果

讨论

1、4×Aβ15疫苗比Aβ42疫苗减少了TCR阳性细胞在Tg2576鼠脑内的浸润，可能更具安全性。

2、4×Aβ15疫苗比Aβ42疫苗上调Tg2576鼠脑TrkA和p75表达，可能更有利于修复。

3、在纹状体、中脑黑质等部位聚集了较多的TCR阳性细胞值得进一步深入研究。

小结

参考文献

个人简介

致谢

附录