胚胎干细胞条件培养液诱导兔角膜上皮细胞可控性有限增殖的实验研究

摘要

目的:通过研究胚胎干细胞条件培养液对兔角膜旁中央上皮细胞生物学特性的影响和初步机制的探讨,以期为组织工程组织或器官开辟一条快速、安全、高效、在短期内扩增高质量种子细胞的方法。
　　 方法:取兔眼旁中央角膜,组织块法原代培养上皮细胞,对照组为角膜上皮完全培养液培养的细胞；实验组为添加了40％胚胎干细胞培养上清液的条件培养液培养的细胞。倒置相差显微镜观察各组细胞生长形态和状态,比较各组连续传代情况；流式细胞仪检测细胞周期变化情况；利用RT-PCR检测各组角膜上皮细胞标记物(CK3/CK12、P63、ABCG2、Pax6、OCT4)的表达情况；TRAPeze RTTelomerase Detection Kit检测各组细胞端粒酶活性的表达情况；TeloTAGGGTelomere Length Assay法测定各组细胞端粒长度变化情况；SA-B-gal检测细胞复制性衰老。
　　 结果:本研究成功建立了一种利用胚胎干细胞条件培养液促进细胞增殖的培养体系,结果显示:
　　 1.兔角膜上皮细胞在ES条件培养液中能获得高度的增殖活性,22周内在体外连续传代超过55代,而对照组在体外生长均未达3代；实验组细胞形态均一,呈现典型的铺路石状,具有接触抑制性,表达角膜上皮细胞标记物,核型正常,无成瘤性；
　　 2.细胞周期结果显示,条件培养液培养的细胞,随传代,细胞进入S期的比例增加,而处于G1期的比例下降,P0代、对照组P1、实验组P1、P5、P10和P15代细胞处于S期和G1期的比例分别为14％、7.5％、11％、17.1％、20.3％、23.7％和77.9％、86.8％、79.7％、74.6％、72.1％、69.6％;
　　 3.端粒酶活性检测显示,细胞内低表达端粒酶活性；
　　 4.端粒长度检测结果显示,细胞内端粒长度未发生明显变化。
　　 5.SA-β-gal检测,各代细胞中复制性衰老的细胞数无明显差异。
　　 结论:本研究成功建立了一种安全、高效、经济、可控的胚胎干细胞条件培养液诱导成体细胞系统。其能在短期内达到快速扩增细胞的目的,同时延缓细胞衰老的过程并且保持细胞固有的生物学特性,无成瘤性。诱导的细胞用于构建组织工程角膜时,能形成复层上皮并具有初步的功能,诱导的细胞异位表达端粒酶活性,端粒长度未见明显缩短,可能为其获得较强的增殖能力因为之一。这种方法为再生医学中种子细胞的快速获得提供了一种新途径。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果、讨论

全文结论

问题与展望

参考文献

附录

致谢