蜈蚣草中与砷富集相关基因的多态性及正向选择研究

摘要

超富集植物（hyperaccumulator），是指能够超量吸收重金属或半金属（通常为普通植物在同一生长条件下的100倍）并将其转运到地上部分的植物。超富集植物所具有的重金属耐性或积累能力使它们在勘探矿藏、清除土壤或水体重金属污染等应用上具有重要价值；更重要的是，超富集植物往往分布在特定区域且具有较明确的种群历史，因此它们也是研究生物微进化的重要材料。已发现的超富集植物大约有500种，占被子植物总数的0.2％，其中只有十几种能超富集砷（Arsenic，As）。蜈蚣草是第一个被发现的As超富集植物，并且其富集特性是先天性的，即不论是来源于As污染土壤还是正常土壤的蜈蚣草均对As具有超乎寻常的富集能力。关于先天富集植物如何起源存在两种假说，即起源于重金属污染土壤或正常土壤，然后传播到其它的污染土壤和正常土壤。不论哪种假设成立，这种内在的超富集特征对于正常土壤上的蜈蚣草个体来说至少是无害的，因此传统上认为先天富集特性的形成并不是植物对污染土壤的微进化响应过程，其意义可能是植物抵御食草动物啃食的有效策略。令人疑惑的是，最近的研究显示来源于不同污染程度土壤的先天富集植物在金属积累以及编码金属转运蛋白的基因多态性存在显著差异，并且基因多态性直接或间接地与土壤的重金属含量相关。这种矛盾的现象可能是因为不同的基因对于土壤重金属有不同的响应；同时，既然土壤重金属显著影响与超富集相关基因的多态性，它是否能将这些基因的有利变异固定下来，即存在正向选择也不清楚。
　　 本研究以生长于7个砷污染土壤和25个正常土壤的蜈蚣草种群为实验材料，比较这些种群在野外和室内土培条件下As富集能力的差异；同时分析这些种群的中性序列（PvRBCL、PvTRN和PvITS）和与砷富集相关基因的多态性，并基于这些序列构建蜈蚣草种群的系统进化树；进而通过Tajima’s D、Fu and Li’s D和PAML检验，探讨土壤As含量或地理隔离是否显著影响了基因变异以及基因变异与蜈蚣草As富集能力的关系。本研究中所涉及的与砷超富集相关基因包括PvABCT1、PvACR2、PvACR3、PvcTPI、PvGRX5和PvPCS1，其中PvABCT1和PvGRX5在砷胁迫下是诱导表达，而其它为组成型。主要研究结果如下：
　　 1.野外条件下，蜈蚣草在正常土壤和As砷污染土壤上（As含量高达89，131mg kg-1）均生长良好，并且地上部各组织的As含量和土壤As含量显著相关（r=0.201-0.526，P<0.05，n=194）。室内土培条件下，不同种群蜈蚣草的羽叶中As含量均超过1000 mg kg-1（1，017～3，400 mg kg-1），转运系数和富集系数的变化范围则分别为1.3-10.1和7.2-30.5。更为重要的是，污染种群和非污染种群的羽叶中As含量并无显著差异（P=0.947），并且以地上、地下部分As含量和As转运系数聚类分析32个种群的相互关系也证实了来源于污染种群的蜈蚣草并没有聚在一起，而是分散于非污染种群中。这些结果在更大范围上证实了蜈蚣草的As超富集特性是先天性的。同时，不同种群蜈蚣草的As富集能力变异很大，也暗示这些种群遗传变异很高并且存在某种选择压力改变着蜈蚣草的As富集能力。
　　 2.序列多态性分析表明所研究的32个种群的PvITS多态性最高（πtotal=0.0325），而PvRBCL最低（πtotal=0.0012）。与砷富集相关基因的多态性平均值πtotal=0.0097（0.0058～0.0138），显著高于中性序列的多态性πtotal=0.0062。对于中性序列，非污染土壤个体之间的多态性均显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于污染土壤个体之间的多态性；而对于功能基因仅PvABCT1和.PvGRX5，污染土壤个体之间和非污染土壤个体之间的多态性才表现出显著性的差异（P<0.01）。McDonald-Kreitman test没有发现污染种群和非污染种群之间在同义替换和非同义替换上存在着固定的差异。
　　 3.通过Partition homogeneity检验及不同的聚类方法分析所测序列，确定以合并序列（PvITS和PvTRN）和最大似然法（maxmium likelihood，ML）构建32个种群蜈蚣草的系统发育树最优。ML系统树的拓扑结构表明32个种群没有以蜈蚣草来源的土壤性质被区分为污染和非污染二组，而是以地理距离大致划分为4-5组。partial Mantel tests进一步表明基于PvITS租PvTRN的种群间遗传距离与地理距离显著正相关（r=0.153，P=0.001），而与土壤As含量显著负相关（r=-0.090，P=0.045）。功能基因联合考虑时，无论在核酸水平还是氨基酸水平都没有发现其遗传距离与土壤As含量显著相关；而单独考虑每个功能基因时，只有PvABCT1和PvGRX5的遗传距离，在核酸水平或氨基酸水平与土壤As含量显著相关。
　　 4.经Tajima’s D和Fu and Li’s D*检验，位点PvITS和PvTRN的遗传变异符合中性进化理论，大多数功能基因也符合此理论。然而，PvRBCL以及PvABCT1和PvGRX5的Tajima’s D和Fu and Li’s D*显著小于0，显示这些位点或基因可能在功能上受到正向选择。尽管PAML检验结果表明PvABCT1，PvACR2，PvACR3，PvcTPI，PvGRX5和PvRBCL的dN/dS均<1，表明它们受到较弱的正向选择，但PvABCT1和PvGRX5相比于其它基因具有较高的正向选择位点（0.84～.72％vs.0.53～0.79％），并且通过M2a、M8和M8a三个“位点模型”检验后未发现PvRBCL中存在正向选择位点。最值得关注的是PvPCS1，其dN/dS>1表明其受到强烈的正向选择，经检测其正向选择位点的比例高达13.45％。
　　 本研究首次从功能基因进化的角度，揭示了蜈蚣草内与砷富集相关的基因的遗传变异与基因的表达模式（组成型或诱导型）有关，同时组成型或诱导型表达的基因对于选择压力土壤As含量或地理分布有着不同的适应模式。组成表达的基因的变异并不与土壤As含量相关联，它们可能是影响蜈蚣草As超富集的主基因。因此在种内水平上，土壤As含量并不是蜈蚣草.As超富集的主要选择压力。与之相反地是，负责细胞质平衡的基因如PvPCS1，它的表达水平由转录后调节；或诱导表达的基因则与适应性进化相关，这些基因可能与调节植物As富集水平相关，环境因子土壤As含量会对它们产生正向选择或选择清除。

目录

文摘

英文文摘

资金项目

第1章 前言

1.1 超富集植物的进化生物学研究

1.1.1 超富集植物的定义与系统学特征

1.1.2 植物抗重金属污染的进化学研究方法

1.1.3 超富集植物耐性与富集的进化机制

1.2 砷的代谢途径

1.2.1 砷的存在形式及毒性

1.2.2 砷的代谢机制

1.2.3 从土壤到植物根部：砷的还原

1.2.4 从根部到地上部分：砷的络合和区隔化

1.2.5 形态转化：砷甲基化

1.2.6 从植物根部到土壤：砷的溶出

1.3 As超富集植物蜈蚣草及超富集/耐性机理

1.3.1 As超富集植物蜈蚣草

1.3.2 蜈蚣草对砷的富集

1.3.3 蜈蚣草耐性/富集砷的的分子机理

1.3.4 蜈蚣草种群遗传多样性研究

1.4 本研究的提出

第2章 材料与方法

2.1 试剂、溶液配置及主要仪器

2.2 野外生态调查及室内土培试验

2.2.1 采样样地描述

2.2.2 采样方法

2.2.3 蜈蚣草组培繁殖方法

2.2.4 室内土培试验

2.2.5 植物和土壤重金属分析

2.3 分子系统学研究方法

2.3.1 DNA/RNA提取方法

2.3.2 cDNA合成

2.3.3 PvITS、PvRBCL和PvTRN序列的扩增

2.3.4 PvABCT1、PvACR2、PvACR3、PvcTPI、PvGRX5和PvPCS1序列扩增

2.3.5 连接、转化及测序

2.4 数据统计分析

第3章 结果与分析

3.1 蜈蚣草As富集特征：野外调查与室内土培

3.1.1 野外调查

3.1.2 室内土培

3.2 分子系统发育研究结果

3.2.1 蜈蚣草DNA和RNA

3.2.2 PCR产物扩增结果

3.3.3 序列多态性

3.3.4 系统发育树分析

3.3.5 序列变异与地理距离/土壤As的关系

3.3.6 功能基因的正向选择

第4章 讨论与结论

4.1 AS先天富集及起源

4.2 基因型与生态型的关系

4.3 本论文的主要结论

参考文献

在站情况说明

附件(1)：个人简历

附件(2)：在站期间发表的论文和论著

附件(3)：在站期间获得的科研基金及承担的其它课题

致谢