吗啡预处理通过调控miR-133b-5p减轻心肌细胞缺氧再给氧损伤的作用及机制

摘要

背景：
　　microRNAs(miRNAs)是一类新型非编码小RNA，在转录后水平调节靶基因的表达,参与各种病理生理过程。已报道miRNA可以参与调节心肌细胞凋亡、心肌梗死、心肌重塑、心肌缺血再灌注损伤、药物预处理等过程。本课题组前期利用miRNA芯片技术发现miR-133b-5p在心力衰竭大鼠心肌细胞中表达量明显降低，而经历吗啡预处理（morphine preconditioning,MPC）后，miR-133b-5p水平显著升高。本课题拟在前期研究基础上，进一步研究miR-133b-5p介导MPC心肌细胞保护效应的作用及机制。
　　方法：
　　1.miR-133b-5p inhibitor转染效率验证。对数期生长的H9c2心肌细胞长至40-50％细胞融合度时转染miR-133b-5p inhibitor（FAM标记），48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光标记的细胞占总细胞的比例，qRT-PCR验证细胞内miR-133b-5p下降水平。
　　2.miR-133b-5p在心肌细胞凋亡中的作用及其机制。对数期生长的H9c2心肌细胞随机分为3组：正常对照组（CON）、抑制剂组（miR-133b-5p inhibitor）、抑制剂对照组（inhibitor-NC）。CON正常培养，miR-133b-5p inhibitor在细胞长至40-50%融合度时转染miR-133b-5p inhibitor，inhibitor-NC在细胞长至40-50%融合度时转染 miR-133b-5p inhibitor-NC。48 h后收集培养液上清检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性，收集细胞利用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率，最后利用qRT-PCR和Western Blot检测各组凋亡相关分子Fas的表达情况。
　　3. miR-133b-5p在吗啡预处理减轻心肌细胞缺氧再给氧损伤中的作用及其机制。对数期生长的H9c2心肌细胞随机分为5组：正常对照组（CON）、缺氧再给氧组（hypoxia/reoxygenation, H/R）、吗啡预处理组（MPC）、吗啡预处理+抑制剂组（MPC+miR-133b-5p inhibitor）、吗啡预处理+抑制剂对照组（MPC+inhibitor-NC）。CON细胞正常培养。H/R细胞给予缺氧5h、复氧1h处理。MPC细胞在H/R之前给予1?mol/L吗啡预处理10 min。MPC+miR-133b-5p inhibitor细胞在吗啡预处理前24 h转染miR-133b-5p inhibitor。MPC+ inhibitor-NC细胞在吗啡预处理前24 h转染miR-133b-5p inhibitor。吸取各组细胞培养液上清检测LDH活性，细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8,CCK-8）检测心肌细胞活力，流式细胞仪检测细胞凋亡率，最后利用qRT-PCR和Western Blot检测各组凋亡相关分子Fas的表达情况。
　　结果：
　　1.miR-133b-5p inhibitor转染效率验证。H9c2心肌细胞转染miR-133b-5p inhibitor（FAM标记）48后，荧光显微镜下观察发现大于80%的细胞带有绿色荧光标记，qRT-PCR检测发现细胞转染miR-133b-5p inhibitor后miR-133b-5p表达水平明显降低，即转染效率满意。
　　2.miR-133b-5p在心肌细胞凋亡中的作用及其机制。与CON组相比，miR-133b-5p inhibitor组细胞miR-133b-5p表达明显下降，培养液LDH活性增多，细胞凋亡率升高（P<0.05），而inhibitor-NC组细胞miR-133b-5p表达、LDH活性、细胞凋亡率变化均无统计学意义。与CON组相比，miR-133b-5p inhibitor组细胞Fas mRNA与Fas蛋白表达增加（P<0.05），而inhibitor-NC组Fas表达无明显变化。
　　3.miR-133b-5p在吗啡预处理减轻心肌细胞缺氧再给氧损伤中的作用及其机制。与CON相比，H/R、MPC MPC+miR-133b-5p inhibitor和MPC+inhibitor-NC组细胞活力下降，LDH水平增加，凋亡率增加，miR-133b-5p表达下调（P<0.05）。与H/R组相比，MPC组miR-133b-5p表达明显上调，细胞活力增加，LDH水平减少，细胞凋亡率减少，Fas表达下调（P<0.05）。与MPC组相比，MPC+miR-133b-5p inhibitor组miR-133b-5p表达明显下调，细胞活力降低，LDH水平增加，细胞凋亡率增加，Fas表达上调（P<0.05），而MPC+ inhibitor-NC组miR-133b-5p表达、细胞活力、LDH水平、细胞凋亡率、Fas表达变化均无统计学意义。
　　结论：
　　吗啡预处理可能通过上调miR-133b-5p，进一步抑制靶基因Fas mRNA和蛋白表达水平，从而减轻心肌细胞缺血再灌注缺氧再给氧损伤。

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1.引言

2. 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学处理

3. 结果

3.1 总RNA质量和浓度鉴定

3.2 荧光显微镜及qRT-PCR验证miR-133b-5p inhibitor转染效率

3.3 miR-133b-5p对心肌细胞凋亡的影响及其机制

3.4 miR-133b-5p在吗啡预处理减轻心肌细胞缺氧再给氧损伤中的作用及其机制

4. 讨论

5. 结论

参考文献

附录

致谢

综述: miRNA在IPC保护心肌缺血再灌注损伤中的研究进展