线粒体稳态在运动延缓骨骼肌炎性反应中的作用机制研究

摘要

研究目的：炎症与许多疾病密切相关，衰老发生过程伴随着炎症因子慢性进行性升高的现象，并伴有衰老性肌萎缩和骨骼肌线粒体生物合成功能降低。炎症因子能引起衰老性肌萎缩已被明确证实，且抗炎因子治疗可减缓这一过程。IL-6是衰老性肌萎缩发生的必要因子，过表达 IL-6可加速肌萎缩的过程。有证据表明，用IL-6直接孵育骨骼肌肌原细胞，线粒体融合蛋白MFN2表达降低，然而在IL-6引起衰老性肌萎缩过程中线粒体稳态的作用机制尚未明确。运动可作为防治衰老性肌萎缩等相关疾病的重要措施，研究发现中等强度的运动可逆转由 IL-6过表达引起的骨骼肌肌肉质量的降低。本研究首先建立 C57小鼠炎症模型，探讨在IL-6引起的衰老性肌萎缩过程中，骨骼肌线粒体稳态的调控作用以及中等强度耐力运动干预对其的改善作用。
　　研究方法：
　　1、动物模型的建立：8月龄C57雄性小鼠经过适应性喂养及适应性训练一周后，随机分为安静组和运动组。运动组开始中等强度12m/min（76％VO2max）跑台训练，每天30分钟。训练开始后第4周，安静组和运动组各随机分成两组，分别注射 IL-6或生理盐水，最终分为以下四组：
　　①安静生理盐水对照组（R，N=10）；
　　②运动生理盐水对照组（E，N=10）；
　　③安静IL-6注射组（RI，N=10）；
　　④运动IL-6注射组(EI，N=10)。
　　2、通过摘除眼球取血的方式对血清IL-6和TNF-α水平进行ELISA测定。
　　3、骨骼肌线粒体提取定量后，用Oxygraph-2k细胞呼吸测量仪（Oroboros，Austria）测定线粒体态3呼吸（State3）、态4呼吸（State4）并计算呼吸控制比（RCR）；荧光分光光度计测定JC-1标示线粒体膜电位和DCFH-DA方法测定线粒体H2O2生成速率；Western-blotting法测定COX IV、PGC-1α、IL-6、NFκB、TNF-α等参与线粒体稳态及生物合成相关蛋白含量。
　　研究结果：
　　（1）模型建立：ELISA测定小鼠血清炎性因子TNF-α含量：血清ELISA检测安静IL-6注射组小鼠TNF-α含量显著高于安静生理盐水对照组（p<0.05）。运动生理盐水对照组及运动IL-6注射组较安静IL-6注射组TNF-α含量明显降低（p<0.01）。
　　（2）运动和IL-6注射动物模型中，安静 IL-6注射组股四头肌湿重/体重（mg/g）比值显著低于安静生理盐水对照组（p<0.05）；运动生理盐水对照组与运动IL-6注射组之间不具显著性（p>0.05）。
　　（3）小鼠骨骼肌线粒体呼吸功能：中等强度运动训练可以提高线粒体呼吸功能，运动 IL-6注射组小鼠与安静IL-6注射组小鼠线粒体呼吸控制比（RCR）呈现显著性差异（p<0.05）。运动可以显著影响态3呼吸，运动IL-6注射组动物的态3呼吸显著高于安静IL-6注射组动物（p<0.05）。运动生理盐水对照组比安静生理盐水对照组态3呼吸显著升高（p<0.01），但态4并没有显著性变化。
　　（4）各组ROS生成速率：运动生理盐水对照组小鼠ROS生成速率显著性低于安静生理盐水对照组小鼠（p<0.05），并且运动和IL-6注射均能显著影响小鼠线粒体ROS生成速率。与安静IL-6注射组相比，运动IL-6注射组ROS显著性低于安静IL-6注射组（p<0.01）。
　　（5）各组线粒体膜电位结果：运动生理盐水对照组小鼠线粒体膜电位显著性高于安静生理盐水对照组小鼠（p<0.05），安静IL-6注射组膜电位显著低于安静生理盐水对照组（p<0.05）。
　　（6）蛋白表达分析：PGC-1α：在接受IL-6注射的小鼠中，PGC-1α蛋白显著低于其它各组，运动IL-6注射组小鼠骨骼肌线粒体PGC-1α蛋白表达显著高于安静IL-6注射组（p<0.05）；而在接受生理盐水注射的小鼠中，运动对照组显著性高于安静对照组（p<0.05）。COXIV：运动生理盐水对照组小鼠线粒体COXIV蛋白显著高于安静生理盐水对照组（p<0.05）；运动IL-6注射组小鼠线粒体COX IV蛋白显著性高于安静IL-6注射组（p<0.05）；IL-6：安静生理盐水对照组小鼠线粒体IL-6蛋白表达显著高于运动生理盐水对照组（p<0.05），安静IL-6注射组小鼠线粒体IL-6蛋白表达显著高于安静生理盐水对照组及运动IL-6注射组（p<0.05，p<0.01）；NFκB：安静IL-6注射组小鼠线粒体NFκB蛋白显著高于安静生理盐水对照组（p<0.05），运动IL-6注射组小鼠骨骼肌线粒体NFκB蛋白显著低于安静IL-6注射组小鼠（p<0.05）；TNF-α：安静IL-6注射组小鼠骨骼肌TNF-α蛋白比同样条件下安静生理盐水对照组有显著性升高（p<0.01），运动IL-6注射组小鼠与同样条件下安静IL-6注射组相比显著性降低（p<0.05），运动生理盐水对照组小鼠与同样条件下安静生理盐水对照组相比有显著性降低（p<0.05）。
　　研究结论：
　　1、外源性炎性因子IL-6可引起骨骼肌ROS水平升高，同时骨骼肌线粒体呼吸功能降低，线粒体生物合成相关蛋白PGC-1α和COXIV表达降低，影响骨骼肌线粒体能量代谢及线粒体生物合成。
　　2、外源性炎性因子IL-6可引起骨骼肌TNF-α水平升高，引发骨骼肌炎性反应，骨骼肌肌肉质量下降。
　　3、耐力运动训练一方面上调PGC-1α表达，增强线粒体生物合成和线粒体功能；另一方面抑制炎性转录因子NFκB表达，调节抗炎和促炎因子的动态平衡，可延缓骨骼肌炎性发生进程。

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中文摘要

英文摘要

1．前言

2. 实验材料及研究方法

2.1 实验材料

2.2 实验试剂

2.3 研究方法

2.4 数据处理

3. 实验结果

3.1 IL-6诱导炎性模型的建立

3.2 中等强度训练对炎症小鼠骨骼肌线粒体呼吸功能的影响

3.3中等强度训练对炎症小鼠骨骼肌线粒体膜电位的影响

3.4中等强度训练对炎症小鼠骨骼肌线粒体ROS生成速率的影响

3.5 中等强度训练对炎症小鼠骨骼肌相关蛋白的影响

4. 讨论与分析

4.1炎症与骨骼肌线粒体功能

4.2 线粒体稳态与IL-6

4.3 运动与线粒体功能及生物合成

4.4运动的免疫调节

5. 结论

6. 论文不足之处

参考文献

论文综述

附录

致谢

研究生个人简介

研究生期间发表的文章