耐力运动对衰老小鼠骨骼肌线粒体功能和自噬相关基因影响的研究

摘要

研究目的：衰老是生物必然面对的生理过程，对衰老机制的研究，有利于人类延长寿命保持机体功能。线粒体作为细胞内的能量工厂，是维持细胞功能的主要动力来源。当线粒体功能异常时，细胞的生存状态就会改变，进而影响组织器官的功能，导致机体的功能异常，如，衰老、癌症等。有研究表明，自噬作为细胞自身清除和保护机制，可能对衰老有直接的影响。线粒体自噬特异性地清除功能异常的线粒体，避免细胞凋亡或者坏死。有研究报道，在动物实验中线粒体自噬参与了红细胞成熟，神经退行性疾病等发生过程。本研究以15月龄衰老小鼠骨骼肌为研究对象，观察耐力运动后线粒体力能学、自噬及线粒体自噬的情况，探讨运动如何影响线粒体功能、自噬及线粒体自噬水平，以及线粒体自噬发生对于衰老小鼠骨骼肌线粒体功能的影响，并为运动延缓衰老提供理论依据。
　　研究方法：6-8周龄雄性C57BL/6小鼠20只，随机分为安静组（C组）和运动组（E组）。采用耐力跑台运动，小鼠13月龄进行8周耐力跑台训练。每周训练5天，每天40分钟，12米/分（75％VO2max）。运动24小时后处死。每组10只。
　　1）取腓肠肌制备新鲜的线粒体，采用Clark氧电极法检测腓肠肌线粒体呼吸态3（S3）、态4（S4）和呼吸控制比（RCR），荧光素－荧光素酶发光法检测线粒体ATP酶合成速率，荧光分光光度计检测线粒体膜电位以及线粒体ROS生成速率；
　　2）实时荧光定量PCR检测Beclin1、Bcl-2、Bax、Bnip3、Nix、HIF-1α mRNA表达；
　　3）Western-blotting法检测Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白水平。
　　研究结果：
　　1）实验前、后，C组和E组间小鼠体重变化无显著性；
　　2）E组线粒体呼吸态3、态4、RCR及ATP酶合成活力较C组显著升高（分别：P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.05）；
　　3）E组线粒体膜电位MP较C组有显著升高（P<0.05）；
　　4）E组ROS生成速率较C组显著降低（P<0.05）；
　　5）E组Beclin1 mRNA表达和蛋白水平较C组显著下降（分别：P<0.05，P<0.01）；E组Bcl-2 mRNA表达和蛋白水平较C组显著升高（分别：P<0.01，P<0.05）；
　　6）E组Bax mRNA表达和蛋白水平较 C组无显著变化，E组 Bcl-2/Bax蛋白比值较 C组显著增高（P<0.01）；
　　7）E组Bnip3 mRNA和Nix mRNA表达较C组无显著变化；
　　8）E组HIF-1αmRNA表达无显著变化。
　　研究结论：
　　1）8周耐力训练提高衰老小鼠骨骼肌线粒体呼吸功能和膜电位，显著改善线粒体整体功能；
　　2）8周耐力训练降低衰老小鼠骨骼肌线粒体ROS生成水平和自噬水平，推测ROS生成的减少降低了对自噬的诱导作用；
　　3）8周耐力训练未影响衰老小鼠骨骼肌线粒体自噬水平，可能与线粒体功能适应性提高有关。

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1.前 言

2.实验材料及研究方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 常用试剂配制

2.2 研究方法

2.2.1 运动分组与运动方案

2.2.2 实验技术路线

2.2.3 骨骼肌线粒体提取

2.2.4 线粒体总蛋白含量测定

2.2.5 线粒体呼吸功能测定

2.2.6 ATP酶合成活力测定

2.2.7 线粒体活性氧ROS生成速率测定

2.2.8 线粒体膜电位（ΔΨm）测定

2.2.9 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测相关基因表达

2.2.10 Western blot法检测相关蛋白表达

2.2.11 数据统计

3 实验结果

3.1 8周耐力运动对各组衰老小鼠体重的影响

3.2 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌线粒体呼吸功能的影响

3.3 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌线粒体ATP酶合成活力的影响

3.4 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌线粒体膜电位的影响

3.5 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌线粒体ROS生成速率的影响

3.6 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌Beclin1、Bcl-2、Bax mRNA和蛋白水

3.6.1 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌Beclin1 mRNA表达和蛋白水平的影响

3.6.2 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌Bcl-2 mRNA表达和蛋白水平的影响

3.6.3 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌Bax mRNA表达和蛋白水平的影响

3.6.4 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌Bcl-2/Bax蛋白比值的影响

3.6.5 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌HIF-1αmRNA的影响

3.6.6 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌Nix mRNA表达的影响

3.6.7 8周耐力运动对各组衰老小鼠骨骼肌Bnip3 mRNA表达的影响

4 讨论与分析

4.1 耐力运动提高衰老骨骼肌线粒体呼吸功能、膜电位及降低ROS生成水平

4.2 耐力运动对衰老骨骼肌自噬、线粒体自噬相关基因和蛋白表达的影响

4.2.1 耐力运动下调Beclin1 mRNA表达及蛋白水平而上调Bcl-2 mRNA表达及蛋白水平

4.2.2 耐力运动对Bax mRNA表达及蛋白水平无影响

4.2.3 耐力运动对Bnip3和Nix mRNA表达无影响

4.2.4 ROS降低可能是线粒体自噬上游信号因子HIF-1α的负反馈调控

5 结论

参考文献

论文综述

附录

致谢

研究生个人简介