水稻OsSPX家族基因OsSPX1和OsSPX3在磷信号传导途径中的功能研究

摘要

磷是植物生长发育所必需的大量元素。虽然土壤中的总磷含量很丰富，但是可利用磷非常低，因而磷成为限制作物产量的重要因素之一。对植物磷饥饿响应基因的功能研究将有助于人们更好地了解磷饥饿信号传导途径的分子机理，对磷高效吸收和利用优良作物品种的培育，提高粮食产量意义重大。
　　 含SPX（SYG1/Pho81/XPR1）结构域的蛋白在真核生物中广泛存在，但目前为止研究不多。酵母中报道SPX蛋白Pho81很可能与磷信号途径有关。通过对已知的SPX结构域序列和水稻蛋白组数据库进行比对，我们在水稻中发现有5个只编码含有SPX结构域蛋白的基因。根据SPX结构域的保守性由高到低，我们依次将其命名为OsSPX1~5。本研究主要对其中的两个基因OsSPX1(Os06g40120)和OsSPX3（Os10g25310）进行了生物信息学及基因功能的研究。
　　 系统进化树表明，OsSPX1与AtSPX1在进化上亲缘关系较近，OsSPX3与AtSPX3同源性较高，AtSPX1和AtSPX3是已知的拟南芥中参与磷信号传导途径的SPX基因。OsSPX1和OsSPX3都带有3个外显子和2个内含子，且只含有一个SPX保守结构域。OsSPX1基因本底表达水平很低，主要在磷饥饿条件下的水稻根部被强烈诱导表达。OsSPX1的超表达（OsSPXl-Oe）和干涉（OsSPXl-Ri）转基因植株生长矮小，地上部和根部生物量相比野生型(WT)显著减少。在正常供磷条件下，OsSPXl-Ri材料老叶中有枯死斑，而缺磷条件下没有类似的表型；OsSPXl-Ri材料叶片中的无机磷(Pi)含量相比WT约上调了1～2倍，且老叶中磷含量远高于新叶，表明OsSPXl-Ri老叶的枯死病斑是由于Pi超积累引起的磷毒害症状。
　　 为进一步研究OsSPX1基因对水稻体内磷平衡的影响，我们跟踪检测了不同生长时段和不同叶片间的磷含量，结果显示OsSPX1-Ri材料不同叶片包括新叶中的磷含量都显著多于WT，而OsSPX1-Oe嫩叶中的磷含量不及WT。该结果表明OsSPXl基因可能参与抑制水稻根部对磷的吸收，或者水稻体内磷由根部至地上部的转运过程。
　　 通过定量RT-PCR检测发现，OsPHR2超表达转基因材料和Ospho2突变体中OsSPX1基因的表达都受到显著上调，这表明OsSPX1在磷信号通路上位于水稻中核心转录因子OsPHR2和泛素化降解途径E2结合酶OsPH02的下游。另外，包括OslPS1和OslPS2在内的10个磷饥饿响应基因的表达在缺磷培养条件下的OsSPX1-Oe转基因材料中都受到显著抑制，暗示OsSPX1是磷信号传导途径的抑制子。其中，两个磷转运体OsPT2和OsPT8的表达在正常供磷培养条件下的OsSPX1-Oe中就受到显著抑制，相反OsSPX1-Pi材料中这两个基因的表达显著高于WT，进一步暗示OsSPX1-Ri中磷的超积累很可能是由这两个磷转运体基因的上调表达引起的。
　　 由于砷酸盐和磷酸盐的吸收共享磷转运体，结合上述OsSPX1抑制磷转运体基因表达的研究结果，我们初步开展了OsSPX1基因与砷吸收的关系研究。实验发现，OsSPX1-Oe材料中积累的砷含量显著少于WT，而OsSPX1-Ri材料与此相反，这再一次验证OsSPX1的异常表达对磷转运体的影响，同时预示该基因在未来抗砷酸水稻品种的培育中可能具有潜在的应用价值。
　　 此外，我们还对OsSPX3基因的功能进行了初步的研究。结果显示，超表达OsSPX3和超表达OsSPX1对植株生长产生类似的影响，即生长受到显著抑制，并且叶片中的磷积累相比WT少。说明OsSPX3的超表达也打破了植物体内的磷平衡，OsSPX3很可能同OsSPX1一样，参与水稻中的磷信号传导途径。通过定量RT-PCR检测发现，OsSPX3同样参与水稻中以OsPHR2为中心的调控网络，受到OsPHR2的诱导调控和OsPH02的抑制调控，并且OsSPX3超表达材料中OsSPX1和OsPT2基因的表达受到显著抑制，暗示OsSPX3和OsSPX1很可能有互作，而OsPT2的下调表达很可能是导致OsSPX3超表达材料叶片中磷积累降低的主要原因。
　　 综上所述，我们对水稻中只编码含有SPX结构域蛋白的OsSPX家族基因OsSPX1和OsSPX3在磷信号传导途径中的功能进行了研究，发现这两个基因在该信号途径中主要起抑制子作用。此研究结果丰富了水稻中以OsPHR2为中心的磷信号调控网络，为进一步改良和培育磷高效吸收和利用效率的水稻品种提供了理论基础。

目录

文摘

英文文摘

资助

致谢

缩略语表

1 文献综述

引言

1.1 植物磷营养生理学研究概述

1.1.1 植物对磷的吸收、转运及储存

1.1.2 磷与其它元素的互作研究

1.1.3 植物缺磷胁迫下的生理生化响应

1.2 磷信号传导途径因子研究进展

1.2.1 转录水平重要调控因子

1.2.2 转录后水平重要调控因子

1.2.3 植物磷转运体

1.2.4 SPX蛋白

1.3 本研究的目的意义及主要内容

2 水稻OsSPX基因生物信息学分析

2.1 方法

2.1.1 水稻中SPX蛋白的查找

2.1.2 水稻SPX蛋白与已知SPX蛋白的进化树分析

2.1.3 0sSPX家族蛋白与已知SPX蛋白的联配分析

2.1.4 0sSPX1和OsSPX3的序列分析和表达芯片分析数据的提取

2.2 结果与分析

2.2.1 水稻中的SPX蛋白

2.2.2 水稻SPX基因与已知SPX基因的进化关系

2.2.3 0sSPX家族蛋白与已知SPX蛋白的序列相似性

2.2.4 0sSPX1和OsSPX3的结构

2.2.5 0sSPX1和OsSPX3的基因芯片表达值

2.3 小结与讨论

3 0SPX1和OsSPX3基因功能的研究

3.1 材料与方法

3.1.1 水稻培养条件

3.1.2 植物总RNA的提取和Northern Blot检测

3.1.3 RNA的逆转录及半定量RT-PCR和qRT-PCR分析

3.1.4 0sSPX1超表达和干涉（RNAi）载体的构建

3.1.5 农杆菌介导的水稻转化和转基因水稻的鉴定

3.1.6 Southern Blot检测

3.1.7 无机磷、总磷含量的测定

3.1.8 0spho2纯合突变体的鉴定

3.1.9 水稻砷酸盐处理、根取样前预处理和砷含量测定

3.2 结果与分析

3.2.1 0sSPX1基因功能研究

3.2.2 0sSPX3基因功能的初步研究

3.3 小结与讨论

4 结论与展望

5 参考文献

6 攻读博士期间的科研成果