产肠毒素大肠杆菌LTB-K99融合基因的构建与表达

摘要

根据公布的产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxinEscherichiacoli，ETEC)的不耐热肠毒素B亚单位(heat-labileenterotoxinBsubunite，LTB)和K99菌毛抗原的核苷酸序列。设计特异的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增得到LTB和K99基因。回收纯化后将LTB和K99基因用T4DNA连接酶连于克隆载体pBS-T上，热击法转化受体菌大肠杆菌top10，蓝白斑筛选阳性菌落，酶切鉴定、测序，证明其中含有LTB和K99基因片段，分别命名为pBS-LTB和pBS-K99。在此基础上构建LTB-K99融合基因的重组质粒pBS-LTB-K99。将鉴定结果正确的重组质粒和原核表达载体质粒pET-28a用BamHz/xho1分别双酶切，通过T4DNA连接酶将目的基因片段克隆入表达载体中，经菌落PCR、质粒PCR扩增及质粒酶切鉴定，证实融合基因已克隆到表达载体中，且具有正确的读码框和方向性，表明正确构建了LTB-K99融合基因的原核表达载体pET-LTB-K99。利用热击法将重组质粒pET-LTB-K99转化入BL21(DE3)大肠杆菌中，经过IPTG诱导进行蛋白表达，SDS-PAGE、Western-Blot检测所表达的蛋白。 结果：扩增的LTB和K99基因在GenBank进行比对表明保守性高。LTB-K99融合基因全长为966bp，推导其氨基酸序列有322个编码氨基酸，分子量大小为33.8KD。经检测表明无核苷酸插入或缺失现象。经SDS-PAGE、Western-Blot检测表明，成功的构建了pET-LTB-K99重组质粒，并在大肠杆菌中实现了表达。 结果表明：表达产物较丰富，能和ETEC免疫的兔血清发生特异性结合，和国外研究的结果一致，表达的蛋白具有特异性。

目录

学位论文独创性声明及版权授权书

英文缩略语词表

前言

文献综述 产肠毒素大肠杆菌的研究进展

实验研究实验一LTB-K99融合基因的构建与测序

实验研究实验二LTB-K99融合基因的原核表达与检测

结论及创新点

致谢

附件

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表