脑源性神经营养因子对胚鼠大脑皮质神经元发挥保护作用的细胞内信号传导机制

摘要

大量研究表明缺氧是造成神经元死亡的重要原因之一，宫内缺氧可致胎儿宫内窘迫而损伤脑细胞，造成生长发育迟缓，同时因累及神经系统发育中的多个区域而遗留永久性的损伤，成活者常遗留脑瘫、智力低下等严重后遗症。脑源性神经营养因子(brain-dedved neurotrophic factor，BDNF)作为脑组织中含量最丰富的神经营养因子，在中枢神经系统内合成并广泛存在于脑组织，包括大脑皮层、海马、基底前脑、纹状体、下丘脑和小脑，其中以海马和皮层中含量最高。BDNF通过其特异性受体酪氨酸激酶(TrkB)参与细胞的分化、粘着、增殖与成熟等重要的生物学过程。目前已有大量研究表明，在脑外伤、低血糖、脑缺血、脑缺氧及抽搐损伤时，细胞内BDNF及其受体TrkB的表达均受到明显影响，加入外源性BDNF可有效减轻神经元所受损伤。 我们前期已用多种试验方法证明了BDNF对缺氧胚鼠脑皮质神经元有确切保护作用，但BDNF与TrKB结合后将胞外刺激信号传递入核内的机制尚未完全明确。BDNF细胞内信号传递途径主要有两条，即丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路和磷酯酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI-3-K)／AKT信号通路。在大多数情况下MAPK途径是BDNF发挥作用的优势途径，对细胞存活起着重要的调节作用。MAPK家族主要包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-related kinase，ERKl／2)、P38MAPK、c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)。ERK1／2通路主要由生长因子及丝裂原激活后在各种神经元损伤和在细胞应激反应中起保护作用；而P38MAPK和JNK则主要在一系列应激及炎症反应中发挥促细胞凋亡及诱导炎症反应的作用。 目前对BDNF神经元保护作用的细胞内信号传递机制国际上尚存在争论：有研究者认为MAPK／ERK信号通路是BDNF发挥其保护作用的主要通路，但另有一些研究者对这一观点提出异议，甚至发现激活该信号通路不仅不能对细胞起到保护作用，反而可促进细胞死亡。亦有人提出磷酯酰肌醇—3—磷酸酶／AKT(PI-3-K／AKT)通路是启动BDNF神经元保护作用的主要通路。亦有研究发现BDNF可同时激活MAPK／ERK信号通路和PI-3-K／AKT信号通路。BDNF激活的主要信号通路可因神经细胞类型、培养条件及细胞受损方式的不同而不同。本研究在体外培养出高纯度胚鼠脑皮质神经元的基础上，成功建立急性神经元缺氧模型，采用免疫荧光法、MTT比色法、Western Blot等检测方法探讨BDNF对体外培养神经元缺氧保护作用的细胞内信号传递机制。 主要结果如下： 1．体外培养出高纯度胚鼠大脑皮质神经元。采用神经元标志物Tubulin βⅢ和神经胶质细胞标志物GFAP对神经元进行免疫荧光鉴定，星形胶质细胞沾染率<5％。 2．成功建立体外神经元细胞急性缺氧模型。动态观察在不同缺氧时间点(0小时—24小时)神经元细胞的形态学变化。缺氧8小时组神经元绝大部分死亡，细胞崩解现象加剧，细胞脆片增多。 3．用U0126、LY294002及SB203580分别阻断相应的ERK信号通路，PI-3-K通路及P38MAPK通路后，采用MTT比色法检测各组神经元细胞活性，发现U0126、LY294002能够明显减弱BDNF对缺氧神经元的保护作用，而SB203580亦可减弱BDNF的保护作用。 4．应用WestemBolt方法对三条通路即ERK通路，PI-3-K通路及P38MAPK通路进行检测，发现加入BDNF后缺氧神经元磷酸化ERK、磷酸化AKT及两条通路下游的关键核转录因子磷酸化CREB表达明显增强，而磷酸化P38MAPK则未见表达。 5．采用免疫荧光的方法发现加入BDNF后缺氧神经元内磷酸化ERK出现核内转位，而且磷酸化CREB的核内表达增强。 以上结果提示，BDNF可同时激活ERK通路及P13K通路来发挥其对缺氧神经元的保护作用。但究竟其中哪条通路才是其发挥其对缺氧神经元保护作用的主要通路?是两者都有相同的作用还是其中一条是主要通路，另一条是次要途径?对此问题尚需进一步研究，我们也将继续进行探索。

目录

论文说明：中英文缩略语目录

前言

实验设计

第一部分胚鼠大脑皮质神经元的体外培养及鉴定

第二部分切断BDNF信号传导途径对缺氧胚鼠大脑皮质神经元细胞生存率的影响

第三部分BDNF激活的缺氧胚鼠大脑皮质神经元细胞内信号传导通路

第四部分PERK及PCREB在缺氧胚鼠脑皮质神经元细胞内的表达

文献综述脑源性神经营养因子诱导的信号通路

个人简历

致谢