hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究

摘要

目的： 我们的前期研究显示腺病毒介导的CD／5-FC(胞嘧啶脱氨酶／5氟胞嘧啶)系统对卵巢癌有抑制作用。为增强该系统对卵巢癌的靶向性，本课题拟构建复制缺陷型腺病毒载体，用肿瘤特异的人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcfiptase，hTERT)启动子调控胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase，CD)基因，将重组腺病毒转染至人卵巢癌细胞株与人胚肺成纤维细胞，观察病毒对细胞的杀伤作用，为卵巢癌的靶向性自杀基因治疗作初步探讨。 方法： 1．酶切质粒pUCl9-CD后回收得到CD基因片段，以同样的内切酶酶切质粒pSU-Tp并回收载体片段，将回收的两片段连接，得到穿梭质粒 pSU-Tp-CD； 2．将穿梭质粒pSU-Tp-CD及腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染293细胞，利用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD，经PCR鉴定后进行扩增、纯化和滴度测定。 3．以不同感染复数的重组腺病毒Ad-hTERTlp-CD感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞，加入不同浓度的5-FC，MTT法检测受染细胞的存活率。 结果： 1．将酶切回收得到的CD基因片段及pSU-Tp载体片段连接后，得到穿梭质粒pSU-Tp-CD，经酶切及测序鉴定质粒构建正确。 2．穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后第10天出现病毒空斑，提取病毒DNA，经PCR方法鉴定正确后进行病毒的扩增、纯化，经50[％]组织培养感染剂量法测得病毒滴度为1.65×10<'10>pfu/ml。 3．用不同感染复数的重组腺病毒Ad-hTERTp-CD以及不同浓度的5-FC作用于人卵巢癌细胞株SKOV3后，MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低：同样应用100μg/ml的5-FC，当腺病毒MOI分别为0,10,100时，SKOV3细胞的存活率分别为93[％]，54[％]，9[％]。而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用，但远较SKOV3细胞弱(细胞存活率>80[％])。两种细胞存活率的差异有统计学意义(P<0.01)。 结论： 本实验构建了由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD，以制备的重组腺病毒联合应用5-FC作用于人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞，体外实验表明SKOV3细胞的存活率明显低于人胚肺成纤维细胞的存活率。因此可以认为Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力。由于仅进行了体外实验，可通过动物实验或更多的肿瘤细胞实验来进一步检验Ad-hTERTp-CD的靶向性。

目录

声明

前言

第一部分 腺病毒Ad-hTERTp-CD的构建 材料和方法

第一部分 腺病毒Ad-hTERTp-CD的构建 结果

第一部分 腺病毒Ad-hTERTp-CD的构建 讨论

第一部分 腺病毒Ad-hTERTp-CD的构建 小结

第二部分 重组腺病毒Ad-hTERTp-CD对卵巢癌细胞株的选择性杀伤作用研究 材料和方法

第二部分 重组腺病毒Ad-hTERTp-CD对卵巢癌细胞株的选择性杀伤作用研究 结果

第二部分 重组腺病毒Ad-hTERTp-CD对卵巢癌细胞株的选择性杀伤作用研究 讨论

第二部分 重组腺病毒Ad-hTERTp-CD对卵巢癌细胞株的选择性杀伤作用研究 小结

全文小结

参考文献

综述 恶性肿瘤的靶向基因治疗

致谢