禾谷类作物甜菜碱合成途径基因的转录后加工及其特征的研究

摘要

甘氨酸甜菜碱(glycein betaine)属于季铵类化合物，是被用作渗透压保护剂的少数有机化合物之一，在细菌、藻类和一些高等植物以及动物中广泛存在。在植物中已证实甘氨酸甜菜碱可以提高植物抗盐、高温、冷冻胁迫的能力，并保持PSII复合体和Rubisco的结构与活性。在已研究的多数生物系统中通过胆碱途径合成甘氨酸甜菜碱，在植物中普遍采用两步法合成，即胆碱在胆碱单加氧酶(choline monoxygenase，CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)催化下经过两次氧化反应生成甘氨酸甜菜碱。 在已研究植物系统中普遍存在两个BADH同源基因，虽然已从分子水平表明多种植物中甘氨酸甜菜碱合成途径相关基因的存在，但实际上植物积累甘氨酸甜菜碱的能力完全不同。重要粮食作物水稻对环境胁迫敏感，不积累甘氨酸甜菜碱。本研究通过对水稻多种诱导条件下两个BADH基因转录本的克隆分析表明，在BADH基因5’端外显子区域有缺失或外源基因插入。经序列分析，BADH基因5’端序列的缺失/插入将导致移码而提前终止以及翻译起始密码或功能结构域的丢失。小麦、玉米、大麦也发现类似现象，但双子叶植物菠菜、拟南芥和蕃茄的BADH基因及水稻的BADH-like基因则被正常剪接。 水稻基因组中除有2个BADH基因外，也包含一个CMO基因，但却不积累甘氨酸甜菜碱。与菠菜CMO编码蛋白的比较表明，水稻CMO也具有[2Fe-2S]结构域和一个保守的非亚铁血红素铁结合域，可以组成CMO的活性中心，但却未检测到水稻的CMO活性。本研究通过对水稻多种诱导条件下CMO基因转录本的克隆分析表明，在大量CMO基因转录本中有5’端编码区序列缺失，及多种选择性剪接事件特别是第2外显子保留的发生。经序列分析，CMO基因转录本的异常加工将导致移码后提前终止及翻译起始密码或功能结构域的丢失。玉米中也发现类似现象，但菠菜的CMO基因则被正常剪接。BADH和CMO基因在转录后加工方式上的不同可能是造成植物物种间甘氨酸甜菜碱积累不同的原因。对两个BADH和CMO基因大量转录本的序列分析也表明，有相似序列成对存在于异常加工转录本的缺失/插入位点两侧，(命名为short-direct repeats，SDR)。不同胁迫条件下缺失位点的选择也发生变化，表明SDR序列元件可能与这种转录后加工方式对缺失/插入位点的识别有关。 利用水稻BADH和CMO基因中的缺失序列在水稻基因数据库中进行检索，选取带有SDRs的候选基因，在不同条件水稻样品中进行RT-PCR和序列分析以对其加工方式进行检测。结果表明，大部分候选基因有类似于水稻BADH和CMO基因的转录后加工，在这些候选基因缺失/插入序列的5'和3'端也存在类似的SDR序列，此外，也发现发生于同一基因的反式作用。拟南芥结合蛋白候选基因测序结果显示，其中1个基因除正常剪接、选择性剪接外，也有两端存在SDR序列的序列缺失以及部分外显子序列的重复，而这种序列缺失和重复在基因组水平则未检测到。 对本研究中检测基因的基因结构特征进行初步分析，结果提示：这一过程有其基因结构基础，又可能是被调控进行的；对缺失序列5'和3'端边界二核甘酸序列的分析表明这种加工方式的识别机制与选择性剪接不同；对本研究中得到的SDR相似序列的比较表明，不同基因、物种来源的SDR相似序列具有序列相似性，这也符合生物进化的原则。

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论文说明：图表目录

声明

第一章禾谷类作物两个BADH基因的转录后加工

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1不同诱导条件对水稻的生长抑制

3.2不同诱导条件下水稻BADH基因的表达

3.3水稻BADH基因的转录后加工

3.4其他禾谷类作物BADH基因的表达及转录后加工

3.5双子叶植物BADH基因的表达与加工

4讨论

4.1禾谷类作物BADH基因转录本的转录后加工

4.2水稻BADH2基因与香味的关系

4.3 BADH基因转录后加工中的反式作用

4.4不同植物来源SDR序列的比较

小结

参考文献

第二章水稻CMO基因的转录后加工

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1水稻CMO基因的表达

3.2水稻CMO基因的转录后加工与选择性剪接

3.3 CMO基因在玉米和菠菜中的表达与加工

4讨论

4.1水稻CMO基因结构

4.2植物基因在逆境下的选择性剪接

4.3选择性剪接与两端存在SDR转录后加工方式的比较

4.4水稻BADH和CMO基因SDR的比较

小结

参考文献

第三章水稻其他基因的转录后加工及其特征的分析

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1水稻和拟南芥候选基因的选择

3.2候选基因的表达和转录后加工

3.3 SDR介导的转录后加工方式的初步分析

4讨论

4.1候选基因的生物学功能

4.2可能机制的推测及其他

小结

参考文献

文献综述：甜菜碱合成及选择性剪接等转录后加工方式研究进展

致谢

在读期间发表和待发表的论文及获奖情况