小熊猫（Ailurus fulgens）微卫星分子标记筛选及其应用研究

摘要

小熊猫是国家二级重点保护野生动物，由于乱捕乱猎和生境破坏，其数量急剧减少，现存数量估计为16,000-20,000只。目前对于小熊猫的研究多集中在形态、分类、系统演化和生态学等领域，对小熊猫的遗传多样性研究较少。 微卫星DNA属于共显性的遗传标记，在人、家畜研究中得到广泛应用，本文构建小熊猫的微卫星文库，筛选多态性好的座位对于小熊猫的遗传多样性进行初步的分析。 本次研究利用了链亲和素和生物素之间有强亲和的原理，构建了小熊猫的三个微卫星文库-(CAA)<,8>，(GGA)<,8>，(GATA)<,6>。用PCR的方法从3个文库中筛选阳性克隆，其阳性克隆率分别为4％，4.4％，7.8％，通过测序，我们找到以下重复序列：(CAA)<,n>3个，(GGA)<,n>12个，(GATA)<,n>37个，(CCA)<,n>2个，(AC)<,n>27个。对其进行筛选，找到较好多态性座位28个。 用这28个座位对于成都大熊猫繁殖基地、郫县养殖场和云南昆明动物园的圈养小熊猫做遗传多样性分析。这28个座位在三个种群中的等位基因数分别为4～15个，2～13个，2～4个，平均每个座位的等位基因数分别为9.09个，6.69个和3.72个。熊猫基地种群表观杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.050～0.950和0.251～0.899。郫县私人养殖场种群表观杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.111～1和0.442～0.953。昆明动物园种群表观杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0～1和0～1。总共的平均表观杂合度(Ho)为：熊猫基地0.624643，郫县0.576964，昆明动物园0.535714。对于期望杂合度(He)，总共的平均期望杂合度为：熊猫基地0.703，郫县0.757，昆明动物园0.691。28个微卫星座位的多态信息含量(PIC)最低为0.195(Aifu-5，昆明动物园)，最高为0.897(Aifu-31，郫县)。根据Botstein等提出的衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，当PIC>0.5时，该座位为高度多态座位，0.25

目录

声明

第一章小熊猫基因组微卫星富集文库的构建

1引言

2材料和方法

2.1材料

2.2试剂

2.3方法

3实验结果

3.1小熊猫基因组富集文库的建立

3.2微卫星DNA的PCR筛选

3.3微卫星序列分析

4讨论

第二章多态性微卫星座位的筛选

1引言

2材料和方法

2.1实验材料

2.2实验仪器和试剂

2.3实验方法

3实验结果

3.1序列分析结果

3.2引物设计结果

3.3引物筛选的结果

3.4电泳结果

4讨论

第三章圈养小熊猫遗传多样性研究

1引言

2材料和方法

2.1样品采集

2.2基因组DNA的提取

2.3设计小熊猫微卫星引物及优化PCR条件

3实验结果

3.1小熊猫28个多态性微卫星位点等位基因大小及其数量

3.2小熊猫28个多态性微卫星位点的基因纯合率和稀有基因比例

3.3 Hardy-Weinberg平衡检验

3.4 28个微卫星座位的遗传多样性

4讨论

4.1实验样本的选择

4.2三个圈养种群小熊猫的遗传多样性

4.3加强对于小熊猫遗传多样性的保护

5结论

综述小熊猫的研究现状及微卫星技术在遗传多样性研究中的应用

参考文献

在读期间发表的论文

致谢