磁电联合刺激对大鼠皮层运动区损伤并神经干细胞移植功能重塑的影响

摘要

中枢神经系统皮层功能区的损伤是造成人体残废，病人生存质量严重下降，社会经济负担明显增加的主要原因之一。如何有效促进中枢神经系统损伤后的修复，重建皮质区功能，一直是神经科学研究的重点和难点。电刺激作为促进神经损伤后功能恢复的重要手段之一，已广泛的应用于临床。近年来，经颅磁刺激 (transcranial magnetic stimulation，TMS)作为一种新的无创性治疗手段得到人们的广泛关注，国外己开始将此技术用于临床治疗神经系统退性行疾病，但均未达到理想的效果。究其原因，磁刺激或电刺激因各自的缺陷而不能发挥理想的治疗作用。如何更加有效地发挥磁、电刺激在中枢神经系统损伤后功能重塑中的作用，是许多医学工作者所思考和探索的难题。 本课题在参考和总结国内外现有的磁、电刺激重塑中枢神经系统功能方面的研究资料基础上，自行研制了磁电联合发生设备，并在大鼠运动皮层特定区域损伤模型上使用，结合神经干细胞移植的方法，研究了磁电联合刺激对重塑运动皮质功能的促进作用，并观察了磁电联合刺激对损伤局灶范围内BDNF和NCAM含量的影响，评价磁电联合刺激在损伤运动皮层功能修复中的作用和价值。结果如下： 1．磁电刺激仪的研制在综合了电刺激疗法和磁刺激疗法原理的基础上，将电刺激和磁刺激进行有效的结合，通过对动物可耐受的电刺激参数及磁刺激参数的优化组合，研制成功了磁电联合刺激仪。该仪器可以同步产生磁、电信号输出，并能将刺激通过不同路径同步到达大脑皮质，电刺激是刺激左侧腓肠肌(外周刺激)，而磁刺激是直接刺激脑部(包括大脑皮层)，经技术处理后，两种刺激信号能同步到达大脑皮层组织。在动物实验中，我们将成年SD大鼠分为3个大组，分别为：单纯电刺激组(electrical stimulation group，ESG)、单纯磁刺激组(transcranial.magnetic stimulation group，TMSG)和磁电联合刺激组(Transcranial magnetic and electrical stimulation.group，TMESG)。其中，ESG 40只大鼠，其中，根据不同的电刺激强度又分为4个小组，每组10只动物；TMSG 10只动物；TNESG 70只大鼠，根据不同的电、磁刺激强度分为7个小组，每组10只大鼠。采用单纯电刺激、单纯磁刺激和磁电联合刺激的方法，监测刺激后，由电刺激大脑皮层运动区诱发的对侧腓肠肌电动作电位的潜伏期和幅度。在TNESG组，一方面固定电刺激参数(15mV)，观察不同磁刺激强度下的腓肠肌电动作电位潜伏期和幅度以及动物的生命体征；磁刺激设置三个强度组(300、660、800mT)，每组 10 只大鼠。另一方面，固定磁刺激参数(660mT)，观察不同电刺激强度下的腓肠肌动作电位的潜伏期和幅度以及动物的生命体征；电刺激设置四个强度组(15、20、30、50mV)，每组10只大鼠。由此筛选出一套最佳磁电联合刺激方案。筛选出的最佳方案为：磁电联合刺激时，磁刺激强度660mT，刺激时程0.2ms；电刺激强度20mV，脉冲宽度200ps；同步时间10ms。第三、四部分研究中所采用的磁电联合刺激方案为在上述最佳磁电刺激参数基础上，联合刺激的频率为1对/5s，连续刺激30min，间隔2 h，共刺激3次。该仪器解决了能在大鼠可耐受的安全阈内进行相关实验研究，并实现设备小型化制造的技术问题，填补了国内空白。 2.分子生物学方法的建立采用神经干细胞体外分离、培养、鉴定和冻存及复苏技术，成功分离培养了胚胎大鼠神经干细胞 (neural stem cell，NSCs)，培养方法简单实用，在短时间内能够获得大量的NSCs，并且能够较好地保持NSCs的形态结构的完整性，细胞生长状态良好，为第三、四部分实验奠定了基础。 3.磁电联合刺激对大脑皮层运动区损伤模型大鼠瘫痪肢体功能恢复的促进作用实验选用SD大鼠50只，分为5组，即正常对照组(normal group，NG)、单纯损伤组(simple destroy group， SDG)、损伤加移植神经干细胞组(transplation NSCs group，TNG)、损伤加磁电联合刺激组(destroy and transcranial magnetic and electrical stimulation group，SDSG)、损伤后移植神经干细胞加磁电联合刺激组(transplation NSCs and TMES group，TNSG)，每组10只动物。大鼠大脑皮层运动区损伤手术后3 d，神经功能全部为I～Ⅱ级缺失。术后5d时，与SDG比较，TNG大鼠肢体瘫痪情况有所好转，但无统计学意义(P>0.05)；与TNG和SDG比较, TNSG大鼠肢体瘫痪情况明显好转(其中1只动物的肢体运动功能完全恢复)，差异有统计学意义(P<0.05)。这些结果提示，磁电联合刺激对大鼠大脑皮层运动区损伤后瘫痪肢体的功能恢复有明显的促进作用。 4.磁电联合刺激对大鼠运动皮层损伤灶及其临近区域BDNF和NCAM的影响本部分实验共用SD大鼠78只，其中NG 6只；SDG、TNG、SDSG和TNSG各18只，每组损伤后1d、3d、5d三个时间点各6只。BDNF表达情况：与NG比较，在SDG，损伤后出现BDNF表达增强，损伤后1d其表达最强(P0.05)；其他三组 (TNG、SDSG和TNSG)的BDNF变化趋势与SDG一致，但5d时仍高于NG。与SDG相比，TNG的BDNF表达增强更为显著，1d和3d时表达水平差异有显著性(P0.05)；TNSG在术后1d和3d，BDNF表达水平显著增高(P<0.05)，5d时差异无显著性(P>O.05)。与TNG相比，TNSG各时间点的BDNF无显著差异(P>O.05)。与SDSG相比，1d和3d时BDNF表达水平均显著增高(PO.05)。 NCAM的表达情况：与NG比较，SDG术后1d时，NCAM的表达增高(P0.05)。 TNG、SDSG和TNSG组变化趋势与SDG一致，都是在1d时表达最高，以后逐渐回降；但是TNG与SDG相比，NCAM表达水平的升高更为显著，而且3d时仍有显著高表达(P<0.01)，5d时才回复到正常水平(P>O.05)。与SDG相比，SDSG各时间点的NCAM的表达差异不显著(P>0.05)，但TNSG各时间点的NCAM的表达显著增高(P

目录

声明

摘要

前 言

第一部分磁电联合发生设备的研制

材料和方法

结果

讨论

附图

参考文献

第二部分胚胎大鼠神经干细胞分离和培养

材料和方法

结果

讨论

附图

参考文献

第三部分磁电联合刺激对动物皮层运动区损伤后瘫痪肢体功能恢复的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第四部分磁电联合刺激对大鼠运动皮层损伤灶及其临近区域BDNF和NCAM的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

创新点

综述：脑内组织移植研究及临床应用现状

在读期间发表的论著

致谢