甜叶悬钩子和明日叶来源UGT基因的发掘、克隆及功能鉴定

摘要

在植物中很多具有活性的天然产物以糖苷的形式存在，其糖苷化由糖基转移酶（glycosyltransferase, GT），主要是UDP-糖基转移酶（UGT）催化产生。研究这些酶对于认识植物中功能性天然产物糖苷的形成和利用有积极意义。相比于传统的植物提取天然产物的方式，生物合成通常具有高效、安全、经济等特点。随着生物技术的发展，利用生物方法合成有价值的有效成分已经成为提高天然产物产量和改善天然产物品质的重要途径。利用高通量转录组测序的方式挖掘关键酶基因，克隆以及在合适的系统中进行体外高效表达，为研究天然产物生物合成提供了重要的平台。
　　甜菊糖苷（steviol glycosides）是一类以贝壳杉烯（kaurane）为母核的四环二萜类糖苷化合物，共同的苷元为甜菊醇（steviol），其中的一些成分具有极高的甜度，尤其是菊科植物甜叶菊中提取的甜叶菊糖苷（stevioside），因其高甜度、低热量、安全无毒等特性而作为代糖添加剂广泛应用于食品、饮料等工业生产中[1-2]，被誉为继蔗糖和甜菜糖之后的“世界第三类糖源”[3-4]。甜菊糖苷迄今仅在四个植物物种中被报道过，分别是菊科甜菊属的甜叶菊（Stevia rebaudiana）和Stevia phlebophyllaA. Gray[5]、蔷薇科悬钩子属甜叶悬钩子（Rubus suavissimusS. Lee）[6]以及伞形科当归属明日叶（Angelica keiskei(Miq.) Koidz.）[7]。本研究选择甜叶悬钩子和明日叶两种植物作为研究对象，以两种植物的叶片高通量测序获得的转录组数据为基础，分别从转录组数据分析、酶基因的挖掘与克隆、基因的异源表达、酶功能测定等方面研究甜叶悬钩子和明日叶中涉及贝壳杉烯型四环二萜化合物生物合成的糖基转移酶。本文的研究内容主要包括以下几个方面：
　　1）甜叶悬钩子（Rubus suavissimusS. Lee），又名甜茶、甜叶覆盆子，属于蔷薇科悬钩子属，是广西特有的野外珍稀天然植物[8-10]。甜叶悬钩子能生产与甜叶菊中结构类似的贝壳杉烯型四环二萜糖苷类化合物，但涉及其合成途径的关键UGT尚不明确。本研究基于甜叶悬钩子叶片转录组数据，对其中注释的191条推测UGT基因序列进行生物信息学分析，选择部分序列（氨基酸数250~600）与已知的植物UGT构建进化树，筛选出62条可能和甜菊糖苷型化合物合成有关的具有完整全长的糖基转移酶基因，成功克隆了其中的40条，将其甜菊醇类底物共同孵育后筛选出具有相应底物糖基化活性的UGT六条，其中四条具有类似UGT74G1酶活性，催化甜菊醇母核的19位羧基 O的糖基化，一条具有类似UGT85C2酶活性，催化甜菊醇的13位糖基化，另有一条具有类UGT91D2活性，可能催化steviol-19-O-β-D-glucoside的双糖基化。研究完成了甜叶悬钩子中从甜菊醇到甜茶素（rubusoside）合成路径中两步糖基化所需的UGT的鉴定。此外，测定了RsUGT41转化甜菊醇生成steviol-19-O-β-D-glucoside的酶动力学参数。
　　2）明日叶（Angelica keiskei(Miq.) Koidz.），属伞形科当归属多年生草本植物。本研究针对明日叶叶片转录组数据进行分析，获得151条注释为UGT序列，对这些推测的UGT序列进行系统进化分析，对明日叶 UGT（AkUGT）进行家族归类和分组，对A、D、E、G、H及L六组中的82条UGT序列进行进一步分析，临时编号为AkUGT1~82。筛选以上82条序列中具有完整ORF和基因全长序列23条，对其进行全长克隆和重组质粒构建，最终克隆得到序列21条，90％的克隆序列与原cDNA序列匹配度>99%。将重组质粒转入大肠杆菌表达宿主中表达，表达粗酶液分别与甜菊醇（steviol）、瑞鲍迪苷A（Rebaudioside A）、甜菊单糖苷（steviolmonoside）、甜菊双糖苷（steviolbioside）以及steviol-19-O-β- D-glucoside底物共同孵育，测定明日叶 UGT转化活性。最终得到两条与UGT74G1功能相似的AkUGT：AkUGT49和AkUGT50，均可催化甜菊醇19位羧基的糖基化，生成产物鉴定为steviol-19-O-β-D-glucoside。
　　3）通过对转录组数据的发掘，以及基因的克隆和重组酶的酶活性鉴定，我们最终从甜叶悬钩子和明日叶中筛选到了八条具有贝壳杉烯型系列底物活性的UGT，我们对这八条序列进行了理化性质、序列多重比对以及蛋白功能域预测等初步分析，为进一步研究其功能特性奠定了基础。

目录

声明

1 引言

1.1植物UDP-糖基转移酶的研究进展

1.2甜菊糖苷糖基转移酶研究进展

1.3 本研究主要内容

1.4 研究意义

1.5 技术路线

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验仪器和试剂

2.3 实验方法

3 甜叶悬钩子UGT挖掘

3.1甜叶悬钩子生物信息分析

3.2甜叶悬钩子UGT的克隆与表达

3.3重组甜叶悬钩子UGT转化产物分析

4 明日叶UGT挖掘

4.1明日叶生物信息分析

4.2 AkUGT表达载体构建与鉴定

4.3 表达产物的SDS-PAGE分析

4.4 重组UGT转化产物分析

5甜叶悬钩子、明日叶活性UGT分析

5.1 序列功能域分析

5.2 序列进化分析

5.3 序列理化性质分析

5.4 序列一致性分析

5.5 蛋白亚细胞定位

5.6 蛋白三维结构预测

6 讨论

6.1 甜叶悬钩子、明日叶UGT生物信息学分析

6.2 甜叶悬钩子、明日叶UGT的原核表达

6.3 甜叶悬钩子、明日叶UGT催化特性分析

6.4 RsUGT41酶动力学测试

7 结论

参考文献

致谢

附录