胰腺癌中多药耐药基因MDR1的表达及其转录调控研究

摘要

肿瘤细胞对多种化疗药物产生的多药耐药性MDR(multidrugresistance)是临床化疗失败的主要原因，MDR的形成机制复杂，目前认为MDRl基因(multidrugresistancegene1)表达异常是导致MDR产生的主要因子。在胰腺癌的临床诊治工作中，探讨胰腺癌中MDRl基因的表达及其转录调控有重要的研究价值。 临床研究应用免疫组织化学法和RT-PCR技术分别从蛋白和基因水平检测MDRl基因在胰腺癌临床标本中的表达，并研究其与胰腺癌根治性术后生存时间之间的关系。研究结果表明，MDRl基因的蛋白表达产物P-gp在胰腺癌中的表达(阳性率79．3％)明显高于正常胰腺、癌旁组织和胰腺良性肿瘤；RT-PCR证实同样的结果；P-gp与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、TNM分期以及术前是否行介入化疗方面无显著性差异，但对根治性术后生存时间有一定的影响。 实验研究通过RT-PCR检测MDRl基因在两株胰腺癌细胞株AsPC．1和BxPC-3中的表达，发现均有较高水平的基础表达。BxPC-3为原发癌细胞株，且其MDRl基因表达要略强于在AsPC．1细胞，因此选择BxPC-3细胞株作为进一步的研究对象。在体外通过逐步增加阿霉素(ADM)浓度筛选，成功构建了胰腺癌多药耐药细胞株BxPC-3/ADM，发现MDRl在诱导早期的耐药中起主导作用，在后期则和多药耐药相关蛋白(MRP)协同发挥作用；我们通过脂质体转染法将MDRlcDNA转入BxPC-3细胞，成功获得了短时的MDRl高表达，稳定转染的单克隆表达尚有待进一步的研究。 利用RNA干扰技术，设计合成了针对MDRl基因的siRNA，并在其上下游分别引入BglII和HindlII限制性酶切位点，通过双酶切连接反应将MDRlsiRNA插入质粒载体RetropSuper多克隆位点中的BglII和HindIII之间，以此构建MDRlsiRNA真核表达质粒Re仃0DSuper-MDRlsiRNA，应用RT-PCR行酶切鉴定，结果显示MDRlsiRNA成功地载入了质粒。采用脂质体介导的方法将MDRlsiRNA表达质粒转染胰腺癌细胞株BxPC．3，应用RT-PCR和Westernblot方法检测BxPC一3细胞中MDRl在基因和蛋白水平的表达变化，研究结果显示MDRlsiRNA表达质粒能显著抑制胰腺癌细胞BxPC-3中MDRl基因的表达，MDRl的蛋白表达水平亦受到明显抑制。 结论：研究结果表明，胰腺癌中MDRl呈高表达，并对根治术后生存时间有一定的影响。胰腺癌细胞株AsPC-1和BxPC-3存在MDRl的高表达；通过逐步增加ADM浓度，同样可以成功构建多药耐药细胞株BxPC．3／ADM；MDRlsiRNA能有效地抑制胰腺癌BxPC．3细胞株MDRl的表达，siRNA技术是一有效调控MDRl基因表达的方法。

目录

前言

第一部分多药耐药基因MDR1在胰腺癌组织中的表达

第二部分多药耐药基因MDR1在人胰腺癌细胞株中的表达

第三部分siRNA对BxPC-3细胞株MDR1表达影响的实验研究

参考文献

结论

胰腺癌术后介入治疗作用的探讨

致谢

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