低氧条件下间充质干细胞对胰岛细胞的保护作用及其机制研究

摘要

背景：
　　胰岛移植是治疗Ⅰ型糖尿病的重要手段。但是在移植的早期由于各种非免疫性的因素的作用,大约有50％的胰岛细胞发生凋亡和坏死。在胰岛细胞的分离、提取过程中,大量的胰岛外周毛细血管被破坏,使得胰岛细胞在分离、保存及移植的早期处于严重的低氧状态。而胰岛细胞本身对于氧分压十分敏感,因此低氧可能是导致早期移植物丢失的主要原因。间充质干细胞由于具有组织修复和支持功能因而被广泛应用于胰岛移植。大量研究表明间充质干细胞可以通过分泌大量保护性生长因子减轻炎症反应和免疫排斥反应,加快血管新生,促进移植物的存活。但是目前对于间充质干细胞保护胰岛细胞方式(直接或是间接)尚不明确,其具体机制研究较少。
　　目的：
　　本实验利用体外直接接触和间接接触(transwell小室模型)的培养方法和体内实验探讨了低氧条件下间充质干细胞保护胰岛细胞的相关机制。
　　方法：
　　1、取 F344大鼠股骨,反复冲洗得到骨髓内的细胞,经反复贴壁离心,传代至3-6代得到实验用大鼠骨髓间充质干细胞。通过流式细胞仪,ELISA,von kossa和油红O染色对获得的间充质干细胞形态、表面标记物及功能进行鉴定。通过逆行经胆管灌注酶解法,histopaque1077密度梯度离心法提取大鼠F344的胰岛细胞,行ELISA检测功能。
　　2、将间充质干细胞与胰岛细胞在低氧条件下共培养24h,实验分组:单独胰岛组,直接接触共培养组和间接接触共培养组(transwell小室将两者分离),另设置常氧下胰岛组作为对照。利用ELISA检测胰岛细胞的分泌功能,TUNEL和流式细胞仪的方法检测细胞的凋亡和坏死情况。
　　3、将提取得到的F344大鼠的胰岛与间充质干细胞移植入裸小鼠左肾被膜下。实验分组单独胰岛组(胰岛细胞移植入左肾下极被膜,以血凝块封堵),直接接触组(预先将间充质干细胞与胰岛细胞混合后移植入左肾被下极被膜,以血凝块封堵),间接接触组(将胰岛细胞移植入左肾下极被膜,将间充质干细胞移植入左肾上极被膜,以血凝块封堵隔离),另有单独移植间充质干细胞于左肾上极的对照组。移植后定期检测血糖水平21天。为进一步研究间充质干细胞对于早期移植物的保护作用机制,相同的实验分组,于移植后48小时取移植肾脏,行免疫荧光化学染色和实时定量PCR检测。
　　4、将GFP标记的间充质干细胞与胰岛细胞系INS-1在低氧条件下共培养24h,实验分组:单独胰岛组,直接接触共培养组和间接接触共培养组(transwell小室将两者分离),另设置常氧下胰岛组作为对照。通过免疫细胞荧光化学染色,western blot和实时定量PCR的方法进行检测相关指标。
　　结果：
　　1、通过反复贴壁离心法,得到间充质干细胞。经流式细胞仪进行表面标记物的鉴定,干细胞表面CD29、CD105、CD90高表达,而低表达造血细胞的标记物如 CD34、CD45、 CD80;ELISA检测分泌IGF-1,HGF,VEGF;具有成骨、成脂多向分化能力。光镜下观察胰岛细胞的形态并计数,ELISA的结果提示胰岛分泌功能良好。
　　2、ELISA结果提示:间充质干细胞能够通过直接接触的方式保护低氧条件下胰岛细胞的分泌功能,而间接接触保护作用并不明显。TUNEL和流式细胞结果提示:间充质干细胞能够通过直接接触的方式提高低氧条件下的胰岛细胞的存活。
　　3、将间充质干细胞与胰岛细胞以直接接触的方式进行移植,可以明显改善胰岛移植物功能,提高移植效率。免疫荧光结果提示:直接接触组中,间充质干细胞能够保护移植早期胰岛细胞内PDX-1的表达。
　　4、免疫荧光染色、western blot及实时定量PCR的结果提示间充质干细胞能够通过直接接触的方式抑制低氧条件胰岛细胞内NF-κB及其下游靶基因的活化,进而上调胰岛素上游调控基因PDX-1和Mafa的表达。细胞间的粘附蛋白E-cadherin可能参与了此过程。
　　结论：
　　间充质干细胞能够以直接接触的方式保护低氧条件下胰岛细胞的功能并提高胰岛细胞存活率。其机制可能是间充质干细胞通过直接接触的方式抑制低氧条件下胰岛细胞的NF-κB及其下游靶基因的活化,进而提高胰岛细胞内insulin的上游调控基因PDX-1和Mafa的表达,而E-cadherin可能参与此过程。

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实验一 大鼠骨髓源性间充质干细胞及胰岛细胞的分离、提取及鉴定

0 引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 低氧条件下间充质干细胞对于体外胰岛细胞的存活及功能保护作用的研究

0 引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 间充质干细胞与胰岛细胞联合移植

0引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 低氧条件下间充质干细胞对胰岛细胞保护作用的机制研究

0 引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢