脂联素通过抑制Nur77线粒体转位减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡

摘要

研究背景：
　　缺血性心脏病严重威胁人类的生命，约占人类总死亡率的1/3。虽然近些年治疗缺血性心脏病的医药技术不断改善和提高，包括溶栓治疗、解痉治疗、冠状动脉旁路移植术、经皮冠状动脉介入（pereutaneous coronary intervention，PCI）术等治疗方法，但是不可避免的发生以氧化应激、钙超载为特点的心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia-reperfusion，MI/R）损伤。MI/R损伤发生的机制与钙超载、氧自由基、微血管损伤及白细胞等方面关系密切，可导致心肌细胞凋亡增加，然而确切的机制尚未完全阐明。MI/R损伤可使心肌细胞凋亡进一步增加，线粒体在MI/R诱导的心肌细胞凋亡中起着非常重要的作用，MI/R损伤使线粒体通透性转换孔开放，线粒体膜的通透性发生改变，释放线粒体促凋亡蛋白，进而引起心肌细胞超微结构、功能、代谢和电生理等方面损伤。心肌细胞的凋亡，加剧了心肌损伤，临床表现为恶性的再灌注心律失常、心脏功能障碍、冠状微循环障碍、心肌梗死面积增大等一系列心血管不良事件。因此，如何防治或减轻MI/R损伤,保护心肌细胞是研究的重点。
　　脂联素（adiponectin，APN）是由脂肪组织分泌的、不受进餐影响的、无明显昼夜节律变化的一种特异性蛋白质，具有抗氧化应激、抗动脉粥样硬化、抗炎、改善胰岛素抵抗、参与糖脂代谢等作用。脂联素的球状结构域（globular adiponectin，gAd）与完全长度脂联素的生物学功能关系密切。APN可保护缺血再灌注的心肌组织，减少缺血再灌注损伤过程中心肌细胞凋亡，减少心肌梗死面积，降低死亡率。目前APN在MI/R损伤中保护心肌细胞的作用机制尚不完全明确。
　　孤核受体Nur77（也称为NR4A1,TR3,和NGFI-B）这一即刻早期基因，正常情况时主要位于心肌细胞核，在缺血/再灌注时，核受体Nur77从细胞核靶向转位至线粒体，导致线粒体释放促凋亡蛋白，促使心肌细胞凋亡。NuBCP-9是Nur77衍生来的小肽段，可以模仿Nur77的行为及功能。核编码的线粒体促凋亡蛋白Omi/HtrA2蛋白、Smac/DIABLO蛋白，正常时储存在心肌细胞线粒体膜间隙，在缺血/再灌注时，Omi/HtrA2蛋白、Smac/DIABLO蛋白可从线粒体膜间隙释放入胞浆，促使心肌细胞凋亡。
　　目前关于APN能否通过抑制Nur77线粒体转位减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡，尚未见文献报道。本研究旨在用外源性APN干预体外建立的心肌细胞缺氧/复氧模型，研究心肌细胞中核受体Nur77、Omi/HtrA2蛋白、Smac/DIABLO蛋白的表达、亚细胞定位及它们之间的相互关系，为缺血/再灌注损伤的病理学机制提供新的思路。
　　研究目的：
　　1．研究核受体Nur77对线粒体促凋亡蛋白Omi/HtrA2、Smac/DIABLO蛋白的亚细胞定位的影响，并探讨三者之间相互关系。
　　2．研究在乳鼠心肌细胞H/R模型中，外源性APN对核受体Nur77亚细胞定位的影响，APN通过抑制Nur77线粒体转位减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡，减轻MI/R损伤，并探讨这些蛋白之间相互关系。
　　实验方法：
　　实验一原代培养乳鼠心肌细胞并建立缺氧/复氧（H/R）模型：
　　脱颈椎处死乳鼠，无菌取其心脏，0.1％Ⅱ型胶原酶分次消化心肌组织，取培养72h的心肌细胞，随机分为四组：1）正常对照组(control组)：正常培养的细胞，不给于任何干预因素；2）缺氧/复氧组（H/R组）：给予缺氧3h，复氧4h；3）Nur77组：用含10％的胎牛血清低糖DMEM培养液将NuBCP-9稀释，使其浓度为15μmol/l，孵育正常培养的细胞36小时，进行实验。4）脂联素+缺氧/复氧组（gAd+H/R组）：gAd6ug/ml孵育乳鼠心肌细胞24小时后，再给予缺氧3h，复氧4h。
　　采用台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒，检测心肌细胞的存活率；采用大鼠抗横纹肌肌动蛋白抗体的免疫化学染色法行乳鼠心肌细胞鉴定；采用Caspase-3活性检测试剂盒检测心肌细胞Caspase-3酶活性；TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡并计算凋亡指数。
　　实验二核受体Nur77的线粒体靶向转位可导致Omi/HtrA2蛋白、Smac/DIABLO蛋白从线粒体释放入胞浆。
　　1．亚细胞器分离
　　各组细胞亚细胞器的分离，严格按照凯基线粒体/细胞核制备试剂盒（南京凯基）的说明书操作，提取实验各组细胞的细胞核蛋白、胞质蛋白、线粒体蛋白；其中，实验各组细胞核蛋白、线粒体蛋白需要在冰上经过细胞超声粉碎机超声。
　　2．取control组和Nur77组，按照上述亚细胞器分离的方法提取实验各组线粒体蛋白和胞质蛋白，且在冰上经过细胞超声粉碎机超声后，用Western-blot方法分别检测上述两组细胞线粒体和胞质中的Omi/HtrA2、Smac/DIABLO蛋白表达水平；
　　实验三脂联素通过抑制Nur77线粒体转位减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡
　　1．取control组和H/R组，提取心肌细胞总蛋白，Western-blot方法检测上述两组细胞Nur77蛋白表达水平；
　　2．取control组、H/R组和gAd+H/R组，按照上述亚细胞器分离的方法提取各组细胞核蛋白、线粒体蛋白和胞质蛋白，且在冰上经过细胞超声粉碎机超声后，用Western-blot方法分别检测上述各组细胞细胞核、线粒体中的Nur77蛋白表达水平。
　　实验结果：
　　1．在体外，成功分离和原代培养 SD乳鼠心肌细胞，成功建立缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡模型。与control组相比，H/R组的Caspase-3酶活性显著升高（p<0.05），心肌细胞凋亡指数显著增加（p<0.05）；给予外源性脂联素球状结构域gAd干预后，可使caspase-3酶活性显著下降(p<0.05)，凋亡指数显著下降（p<0.05）。
　　2．成功提取了各组细胞的亚细胞器即细胞核蛋白、胞质蛋白、线粒体蛋白。与control相比Nur77组线粒体的Omi/HtrA2、Smac/DIABLO蛋白显著减少（p<0.05），而胞质中的Omi/HtrA2、Smac/DIABLO蛋白显著增加（p<0.05）。
　　3．control组和H/R组相比，全细胞总的Nur77蛋白表达水平无明显变化（p>0.05）；与control组相比H/R组的细胞核Nur77蛋白表达显著减少（p<0.05）；与 H/R组相比 gAd+H/R组的细胞核的Nur77蛋白表达高于H/R组（p<0.05）；与control组相比H/R组的线粒体的Nur77蛋白表达显著升高（p<0.05），与H/R组相比gAd+H/R组的线粒体的Nur77蛋白表达低于H/R组（p<0.05）。
　　结论：
　　1．心肌细胞缺氧/复氧损伤可导致心肌细胞凋亡指数增加，Caspase-3酶活性增加。缺氧/复氧前给予外源性 gAd干预心肌细胞24小时，可使Caspase-3酶活性减少，心肌细胞凋亡指数减少。
　　2．Nur77线粒体靶向转位可导致线粒体促凋亡蛋白 Omi/HtrA2、Smac/DIABLO蛋白从线粒体释放入胞浆。
　　3．缺氧/复氧前给予外源性的gAd干预心肌细胞24小时，Nur77线粒体转位显著减少，提示APN可抑制Nur77出核，抑制Nur77线粒体转位，进而减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡。

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前言

文 献 回 顾

1 心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury）

2 脂联素（Adiponectin APN）

3 孤核受体 Nur77

4 线粒体促凋亡蛋白 Omi/HtrA2 蛋白、Smac/DIABLO 蛋白

正文

实验一 乳鼠心肌细胞的原代培养及缺氧/复氧（H/R）模型的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 核受体 Nur77 的线粒体靶向转位可导致Omi/HtrA2 蛋白、Smac/DIABLO 蛋白从线粒体释放入胞浆

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 脂联素通过抑制 Nur77 线粒体转位减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

结论及创新点

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢