基于rRNA、gyrB、rpo基因的螺旋藻、节旋藻系统发育研究

摘要

螺旋藻、节旋藻广泛分布于热带、亚热带的淡水湖泊、盐碱地、湿地和河流中。由于其体内富含蛋白质、矿物质、维生素、不饱和脂肪酸等多种生物活性物质，且生长速度快、生物量大，已被广泛应用于食品、医药保健品、化妆品、能源及环境治理领域，成为全球最具开发利用价值的经济微藻之一。但是关于螺旋藻、节旋藻的分类一直以来都存在问题，目前大规模养殖并广泛应用于商业活动的“螺旋藻”实际均为节旋藻。因此为了获得有效的分类靶基因，澄清当前分类的混乱局面，本论文在收集、分离纯化藻株的基础上，采用16S rRNA基因、ITS区、rpoB基因、rpoC1基因、rpoD基因、gyrB基因和sigF基因进行系统发育分析，主要结果如下:
　　(1)对渤海海滨湿地及周边水域的螺旋藻、节旋藻资源进行调查，发现不同来源水样中螺旋藻、节旋藻的丰度、形态及大小存在明显差异，且不同程度地与其它藻类共存;当水体pH值、总磷含量、总氮含量分别在8.76～9.00、0.11～0.50mg/L和5.1～10.0mg/L时，较适合螺旋藻、节旋藻的生长;通过对部分富集水样的观察镜检，本人分离获得19株纯种藻株，其他同学获得15株纯种藻株。
　　(2)收集国内外现有的螺旋藻、节旋藻藻株并进行镜检，对于形态存在显著差异的样品进一步挑取单藻丝进行纯化，其中惠赠及购买样品中获得29株纯种藻株，实验室原有样品中获得21株纯种藻株，富集水样中分离纯化获得34株纯种藻株。本次实验藻株共84株，其形态包括直线型（23株）、曲线型（4株）、典型螺旋型(51株)以及高度螺旋型（6株）四种。
　　(3)对液氮研磨法、反复冻融法、反复冻融-溶菌酶法、溶菌酶法、超声波法、超声波-溶菌酶法等常用细胞壁破碎方法进行了比较及评价，发现六种方法均能在一定程度上破碎节旋藻细胞壁，且处理后提取的基因组DNA能满足基本的生物学实验要求;统计分析表明反复冻融法、溶菌酶法及反复冻融-溶菌酶法破壁后所获得的DNA浓度（＞2000 ng/μL）显著高于其它方法，液氮研磨法的最低(＜40ng/μL);超声波法所得DNA的OD260/OD280的值大于2.00，其余方法的均在1.90到2.05之间，纯度较高;经PCR扩增16S rRNA基因及ITS区后均得到了单一的目的片段。综合考虑，反复冻融法、溶菌酶法是节旋藻DNA提取时优先考虑的方法。
　　(4)对克隆的7个基因进行了序列测定和分析，发现基于16S rRNA基因、ITS区、rpoC1基因序列构建的NJ树可将实验藻株分为三个类群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类群），Ⅰ、Ⅱ类群群内藻株之间的序列相似度分别为98～100％，90～94％，92～95％，远远高于Ⅰ、Ⅱ类群与Ⅲ类群的序列相似度91～92％，60～65％，75～78％，故合并为两个大类，支持了该类生物分为两个属的结论，80株实验藻株归为节旋藻，4株归为螺旋藻;rpoB和rpoD基因虽将实验藻株划分为两个类群（Ⅰ、Ⅱ类群），但类群之间的相似度94～96％、95～98％远高于外类群不同属间的序列相似度62～68％、73％，说明这两个基因不能作为螺旋藻、节旋藻在属及其以下水平的分类标记;部分藻株的gyrB基因、sigF基因无扩增产物，但根据已有藻株的聚类结果，推测gyrB基因与16S rRNA基因、ITS区、rpoC1基因的聚类结果类似，而sigF基因则与rpoB基因和rpoD基因的聚类结果相类似。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 螺旋藻属、节旋藻属概述

1．1．3 螺旋藻、节旋藻的利用价值

1．2．1 以形态特征为依据的分类现状

1．2．2 以生理生化特征为依据的分类现状

1．2．3 以分子生物学为依据的分类现状

1．3 基因序列在系统发育分析中的应用

1．3．1 核糖体RNA(rRNA)基因

1．3．2 gyrB基因

1．3．3 rpo基因

1．4 系统发育树重建方法

1．5 本研究的目的及意义

第二章 藻的分离纯化与培养

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要仪器与设备

2．2．1 水样的采集及前处理

2．2．2 水质测定

2．2．3 藻体的富集及分离纯化

2．3 实验结果与分析

2．3．1 水样的观察、富集及水质测定

2．3．2 藻丝的分离纯化

2．3．3 藻种的逐级扩大培养

2．4 本章小结

第三章 不同破壁方法对DNA提取效果的影响

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要仪器与设备

3．2．1 藻的培养和鲜藻泥的获得

3．2．2 六种破壁方法

3．2．3 基因组DNA的提取

3．2．4 基因组DNA提取效果检测

3．2．5 16S rRNA基因及ITS区PCR扩增

3．3 实验结果及分析

3．3．2 DNA的浓度、纯度及其百分含量

3．3．3 16S rRNA基因及ITS区PCR扩增结果

3．4 本章小结

第四章 基于不同基因的系统发育分析

4．1 实验材料与仪器、设备

4．1．1 实验材料

4．1．2 主要仪器与设备

4．2．1 基因组DNA的提取及检测

4．2．2 各基因的PCR扩增

4．2．3 基因序列的测定及其生物信息学分析

4．2．4 系统发育分析

4．3 实验结果与分析

4．3．1 各藻株基因组DNA提取效果检测

4．3．2 引物的确定及条件的优化

4．3．3 基于各基因的扩增结果及生物信息学分析

4．3．4 基于各基因的系统发育分析

4．4 本章小结

第五章 总结与展望

5．1 本文结论

5．2 本实验主要创新点

5．3 本实验的不足之处及展望

参考文献

发表论文及参加科研情况说明

附录

致谢