体内构建骨软骨复合体修复骨软骨缺损的实验研究

摘要

目的：关节软骨损伤是骨科临床的常见疾病。人口老龄化引起的关节软骨磨损、退行性变和各种创伤、运动损伤造成的软骨损伤逐日增多，已经成为导致残废、影响生活质量的重要原因。20世纪80年代以来，组织工程技术的迅速发展，为这一难题的解决提供了前所未有的机遇。人们利用软骨组织工程技术，将细胞和支架材料复合培养，修复软骨缺损已经取得了初步成效。本课题研究的目的是采用软骨组织工程技术，体外分离骨髓间充质干细胞(MSCs)为种子细胞，经软骨细胞诱导生长因子的诱导培养后，与聚羟基乙酸(poly glycolic acid; PLA)一聚乳酸(poly 1actic acid; PGA)共聚物(PLGA)支架材料复合培养，观察MSCs在PLGA支架材料上黏附、伸展和增殖情况，并模仿马赛克骨软骨移植术在关节骨软骨缺损深层置入MSC一支架复合体，浅层置入诱导培养后的MSC一支架复合体，紧密压配，体内构建骨软骨复合体，观察其修复的情况。期望能够找到软骨组织工程理想的种子细胞和支架材料。材料和方法 1.取10-12月龄健康比格犬3只，无菌穿刺抽取髂骨骨髓7-8ml，Percoll分离 法分离骨髓间充质干细胞，进行原代、传代细胞培养。取第3代的MSCs，根据是否加入TGFβ<,1>，分为二组：A组，加入TGFβ<,1>10ng/ml；B组，对照组。二组中常规加入含10％胎牛血清的DMEM液。倒置相差显微镜观察细胞生长状况，诱导培养15天后，MTT法观察细胞增殖状况：细胞培养上清液检测糖胺聚糖的含量；免疫组化检测诱导细胞Ⅱ型胶原的分泌。观察骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的情况。 2取经过诱导培养7天的MSCs，调整细胞浓度为5x10<'6>/ml，与PLGA支架复合培养7天，进行复合组织的病理形态学观察；动物实验备用。PLGA支架及MSCs-PLGA支架复合体进行扫描电镜观察。观察骨髓间充质干细胞在PLGA支架内生长增殖情况。扫描电镜观察PLGA支架材料的结构、孔隙率和骨髓间充质干细胞在支架内的黏附和生长情况。 3取10-12月龄健康比格犬10只，在实验犬的双侧股骨滑车处钻直径5mm，深度5mm的骨软骨缺损，深达软骨下区。随机分为3组：A组，作为实验组，10只，左膝软骨缺损处深层植入MSCs复合PLGA支架材料，浅层植入经过诱导培养的MSCs复合PLGA支架材料，紧密压配；B组，作为阴性对照组，10只，阴性对照组，左膝软骨缺损处植入MSCs复合PLGA支架材料；C组，空白对照组，10只，为上述两组的右膝软骨缺损处，不植入任何材料。分别于术后12、16周处死取材，进行大体和组织学观察。 结果 1 细胞形态学改变倒置相差显微镜观察发现，原代细胞接种后1-3日可见少量细胞贴壁，呈短梭形。3日后出现细胞集落，7-8日广泛集落形成。12-14同细胞形成单层。传代细胞贴壁快，7-8日形成单层，细胞核大，胞浆内颗 粒多。力入细胞因子后，细胞生长明显加快，呈漩涡状生长。 2 加入细胞因子TGFβ<,1>(A组)的MTT吸光度值、培养上清液中的糖胺聚糖(GAG)含量和II型胶原分泌均明显高于对照组(B组)。II型胶原免疫组化阳性的MSCs胞浆染色为黄色或棕黄色。 3 电镜观察：扫描电镜显示PLGA支架呈不规则多孔状，孔径控制在200-300μm，孔径率85％，孔壁厚度较均匀，为20-40μm。复合材料显示MSCs细胞在PLGA支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以见到细胞分泌的基质和细胞伪足的铆固作用，表明支架材料具有良好的细胞亲和性。 4 动物实验结果 大体观察：术后16周，实验组缺损修复区组织与周围关节软骨相整合，软骨缺损区被光滑白色半透明的组织覆盖，与周围软骨组织外形无差异；阴性对照组缺损区修复组织与周围软骨部分整合在一起，光泽较差；空白对照组缺损处修复组织低凹，新生组织软，无光泽，与周围软骨组织区别明显。 组织学观察：术后16周，实验组缺损区软骨厚度与正常软骨组织接近，细胞排列出现明显规律，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，与透明软骨组织相似，软骨下骨形成，潮线基本恢复，与周围正常软骨连接较好。阴性对照组软骨细胞排列不规则，中央修复区大部分为纤维组织修复。空白对照组缺损区内主要为纤维组织。 结论 1 MSCs适合成为软骨组织工程的种子细胞。取材方便，Percoll分离法分离可 以获取大量骨髓间充质干细胞，体外培养性能稳定，易于传代扩增，在一定 诱导条件的培养下，可以分化为软骨细胞。 2 TGF-β 1在促进MSCs细胞增殖和向软骨细胞定向分化方面有显著的作用，均明显高于对照组。 3 PLGA支架是理想的软骨组织工程支架材料。具有良好的孔隙率和组织相容 性，MSCs在其中可以很好地黏附、扩展和增殖。 4 MSCs经向软骨细胞定向分化后复合PLGA支架材料，通过紧密压配方式与iSCs—PLGA支架在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。动物实验表明，该复合体修复的软骨缺损明显优于单纯MSCs—PLGA支架复合体，与正常软骨组织形态接近。

目录

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摘要

符号说明

前 言

实验一骨髓间充质干细胞的分离、培养和向软骨细胞方向诱导分化的实验研究

实验二:骨髓间充质干细胞复合PLGA支架的体外培养研究

实验三:PLGA支架两端分别复合向软骨细胞方向分化的MSCs和未分化的MSCs修复犬骨软骨缺损的实验研究

讨 论

结 论

附 图

参考文献

致 谢

攻读学位期间发表的论文: