AD细胞模型星形胶质细胞条件培养液对神经前体细胞分化、突触形成的影响与机制

摘要

本文研究了β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)诱导PC12细胞凋亡，建立Alzheimer'sDisease(AD)细胞模型。 方法：以不同浓度Aβ1-40作用PC12细胞，随机分为四组：对照组，5ug/mlAβ1-40组，10ug/mlAβ1-40组，20ug/mlAβ1-40组，每组分别作用不用时间段。用MTT法检测细胞生存率，吖啶橙免疫荧光技术观察细胞核形态，流式细胞仪检测细胞凋亡率，透射电镜观察细胞超微结构。 结果：三种浓度Aβ1-40均可诱导PC12细胞出现典型凋亡形态学改变，在4h，细胞生存率和细胞凋亡率随着Aβ1-40浓度增加而相应地下降和升高，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；在同一浓度Aβ1-40组内，三种浓度Aβ1-40分别在4h、6h和12h，细胞生存率下降最明显和细胞凋亡率达高峰，分别与对照组和其他时间点相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；6h，10ug/mlAβ1-40组细胞凋亡率较高，细胞死亡碎片率较少。 结论：Aβ1-40诱导PC12细胞出现了典型凋亡特征性改变，从凋亡率高峰的时间和细胞死亡情况，10ug/mlAβ浓度诱导PC12细胞凋亡可作为AD较为理想细胞模型。 细胞模型第二部分：AD细胞模型中星形胶质细胞神经营养素家族基因表达的变化及星形胶质细胞条件培养液BDNF蛋白水平变化 本部分在β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)诱导PC12细胞凋亡的阿尔茨海默病(Alzheimer'sDisease，AD)细胞模型中，观察星形胶质细胞(Astrocyte，AS)表达神经营养素家族基因的变化，包括脑源性神经营养因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，神经营养素-3(NT-3)及星形胶质细胞条件培养液BDNF蛋白水平变化。 方法：PC12细胞经10ug/mlAβ1-40处理后，移去含Aβ1-40的培养液，分为两部分：一部分应用流式细胞技术检测各时间点PC12细胞细胞凋亡率；另一部分与原代培养的新生大鼠皮层星形胶质细胞共同孵育，然后收集星形胶质细胞和星形胶质细胞条件培养液。应用RT-PCR分别检测星形胶质细胞BDNFmRNA、NGFmRNA和NT-3mRNA表达变化，流式细胞技术检测各组星形胶质细胞细胞凋亡率；应用ELASA法检测星形胶质细胞条件培养液BDNF蛋白含量。 结果：RT-PCR结果：BDNFmRNA：A组和B组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；C3组与其他组比较差异明显，具有统计学意义(P＜0.05)；NG-FmRNA：在各组中均有表达，但差异无统计学意义(P＞0.05)；NT-3mRNA：在各组中均未见到表达。ELASA结果：从C2～C3组BDNF升高幅度/d明显增高，与其他组间BDNF升高幅度/d比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；C3组BDNF总量/2d明显升高，与A组、B组、C1组和C2组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，但C3组、C4组和C5组BDNF蛋白总量/2d比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。流式细胞仪结果：在Aβ1-40作用Oh、2h和4h时间点，PC12细胞凋亡率较低，6h达高峰，以后逐渐降低；各组星形胶质细胞细胞凋亡率无改变，差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论：结合Aβ1-40诱导PC12细胞凋亡率检测结果，推测星形胶质细胞BDNFmRNA和BDNF蛋白表达上调与Aβ1-40诱导PC12细胞凋亡有关，是星形胶质细胞神经营养修补代偿机制；来源于新生大鼠皮层区的星形胶质细胞主要以BDNFmRNA表达上调为主，NGFmRNA表达无变化，NT-3mRNA不表达，我们认为PC12细胞受到Aβ神经素性损伤后可能诱导来源于新生大鼠皮层的星形胶质细胞有选择性神经营养素家族基因表达。 第三部分：AD细胞模型星形胶质细胞条件培养液对神经前体细胞分化、突触形成的影响与机制 本部分观察AD细胞模型星形胶质细胞条件培养液对胚胎大鼠皮层神经前体细胞(NPC)体外定向分化为神经元的比例、突触形成、2种突触蛋白和TrkB受体表达的影响；观察ERK信号转导通路是否参与了此过程。 方法：取上次实验备用的各组星形胶质细胞条件培养液(A组～C5组)以1：3比例同DMEM/F12培养基混合，分别对胚胎大鼠皮层神经前体细胞进行诱导分化，用免疫荧光技术对分化细胞进行鉴定和计数，激光共聚焦扫描显微镜观察突触素和生长相关蛋白-43(GAP-43)表达，透射电镜观察成熟突触结构数目，WesternBlot检测Trkβ受体和ERK，p-ERK蛋白表达。 结果：Ⅴ组[ACM(Aβ-PC126h)+NPC组]神经前体细胞，神经元分化比例明显升高，突触素，GAP-43表达明显升高，成熟突触结构数目明显增多，TrkB受体和p-ERK表达明显升高，与Ⅰ组[ACM+NPC组]、Ⅱ组[ACM(PC12)+NPC组]、Ⅲ组[ACM(Aβ-PC120h)+NPC组]和Ⅳ组[ACM(Aβ-PC124h)+NPC组]和Ⅷ(NPC组)比较，差异明显，有统计学意义(P＜0.05)；但在Ⅴ组[ACM(Aβ-PC126h)+NPC组]、Ⅵ组[ACM(Aβ-PC1212h)+NPC组]和Ⅶ[ACM(Aβ-PC1224h)+NPC组]上述指标持续维持较高水平，三组之间差异无统计学意义(P＞0.05)；ERK在各组均有表达，各组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论：在体外AD细胞模型中，来源于新生大鼠皮层的星形胶质细胞有助于促进来源于胚胎大鼠皮层的神经前体细胞向神经元分化和突触形成，并且BDNF-TrkB-ERK信号转导通路参与了此过程，为AD神经干细胞修补替代治疗增加了可能性。 实验路线第一部分AD细胞模型的建立 第二部分阿尔茨海默病细胞模型中星形胶质细胞神经营养素家族基因表达的变化及星形胶质细胞条件培养液BDNF蛋白水平变化 第三部分AD细胞模型星形胶质细胞条件培养液对神经前体细胞分化、突触形成的影响与机制

目录

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中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

实验路线

第一部Alzheimer's Disease细胞模型的建立

第二部分AD细胞模型中星形胶质细胞神经营养素家族基因表达的变化及星形胶质细胞条件培养液BDNF蛋白水平变化

第三部分AD细胞模型星形胶质细胞条件培养液对神经前体细胞分化、突触形成的影响与机制

本研究创新性的自我评价

综 述骨髓基质细胞和神经干细胞治疗中枢神经系统疾病的可能性分析

在学期间科研成绩

致 谢

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