TRAF6介导鼠伤寒沙门氏菌感染诱导的STAT3激活的机制研究

摘要

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S. Typhimurium）能够通过Ⅲ型分泌系统（Type III secretion systems，T3SSs）将效应蛋白注入宿主细胞，这些效应蛋白按照一定的时序性诱导宿主细胞基因表达模式发生改变，将细胞代谢调整到有利于沙门氏菌病原体在胞内存活并繁殖的代谢模式。前人研究表明，沙门氏菌感染过程中利用Salmonella pathogenicity island-1（SPI-1）T3SS效应蛋白SopB、SopE和SopE2激活信号转导和转录活化因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription3，STAT3）的磷酸化，但是对于该STAT3磷酸化激活的分子机制还不清楚。本课题在实验室前期研究工作的基础上，利用免疫印迹（Western bolt）分析技术发现与志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌不同，沙门氏菌感染特异性的诱导TRAF6蛋白发生修饰。进一步利用免疫共沉淀技术（IP）分析发现该TRAF6修饰为自泛素化修饰。通过构建ΔinvA、ΔsopB、ΔsopE2以及ΔsopB/sopE2突变体发现，SPI-1 T3SS效应蛋白SopB和SopE2特异性地诱导TRAF6的自泛素化修饰。已知，MAPKs、NF-κB和 STAT3是宿主细胞三条主要的转录调节信号通路，通过检测TRAF6对三条信号通路的影响，利用沙门氏菌分别感染Traf6+/+MEF细胞和Traf6-/-MEF细胞，发现与Traf6+/+ MEF细胞相比，Traf6-/-MEF细胞中TRAF6的缺失不同程度的抑制了沙门氏菌感染早期ERK、p38的磷酸化激活以及 NF-κB的激活。区别较大的是到感染后期（感染8-16小时），TRAF6的缺失显著影响STAT3的磷酸化激活。从时间效应上发现，STAT3 pY705磷酸化激活的时间与SPI-1 T3SS效应蛋白SopB和SopE2引起的TRAF6的泛素化时间恰好吻合，暗示TRAF6和STAT3 Y705位磷酸化之间存在潜在的联系。为了进一步探索TRAF6泛素化与STAT3磷酸化之间可能存在的关联，我们将TRAF6第70位半胱氨酸（Cys）和第124位赖氨酸（Lys）分别突变为丙氨酸（Ala），并在Traf6-/-MEF细胞中表达野生型TRAF6、TRAF6（C70A）和TRAF6（K124A）突变体，随后用沙门氏菌进行感染，发现与表达野生型TRAF6的细胞相比，在Traf6-/-MEF细胞中表达C70A和K124A突变体不仅显著减少了TRAF6的自泛素化，同时也显著减少了STAT3磷酸化。表明，SPI-1 T3SS效应蛋白SopB/SopE2引起的TRAF6的泛素化参与了STAT3的磷酸化激活。
　　本研究揭示了沙门氏菌感染机制中的一种新策略，即T3SS效应蛋白通过将宿主蛋白进行泛素化修饰并介导了宿主蛋白的磷酸化激活，引起宿主细胞的转录重编程，使宿主细胞内的环境转变为有利于沙门氏菌生存和繁殖的模式。这一发现将为设计和筛选竞争性抑制剂或分子结构类似物，寻找潜在的用于沙门氏菌感染治疗并提高预后治疗效果的小分子药物开发提供重要靶点和理论依据。

目录

声明

第一章 前 言

1.1 课题的研究背景

1.1.1 沙门氏菌的研究概况

1.1.2 沙门氏菌通过STAT3转录因子驱动肠上皮细胞转录重编程

1.1.3 蛋白质的泛素化修饰

1.2 课题的研究重点

1.2.1 本课题研究的意义

1.2.2 本课题研究的技术路线

1.2.3 本课题研究的关键技术

1.2.4 本课题的创新之处

第二章 材料与方法

2.1.1 细菌菌株

2.1.2 细胞

2.1.3 质粒

2.1.4 抗体

2.1.5 主要实验试剂

2.1.6 主要实验仪器

2.2.1 细胞培养

2.2.2 细菌培养

2.2.3 细菌感染

2.2.4 SDS-PAGE电泳

2.2.5 免疫印迹（Western bolt）

2.2.6 免疫荧光显微激光共聚焦技术

2.2.7 沙门氏菌在宿主细胞中存活数的测量方法

2.2.8 免疫沉淀

2.2.9 感受态细胞制备方法

2.2.10 表达载体构建

2.2.11 突变体构建

2.2.12 磷酸钙转染

2.2.13 细胞膜分离

2.2.14 统计分析

第三章 实验结果

3.1.1 不同细菌感染对宿主细胞中TRAF6的影响

3.1.2鼠伤寒沙门氏菌感染对不同细胞中TRAF6的影响

3.1.3 TRAF6自泛素化修饰的检测

3.1.4 pBAD24-invasin表达载体的构建

3.1.5鼠伤寒沙门氏菌的T3SS效应蛋白对TRAF6泛素化修饰的影响

3.2.1 TRAF6功能的探索

3.2.2 TRAF6对STAT3磷酸化入核影响

3.2.3 TRAF6对沙门氏菌在细胞内繁殖的影响

3.2.4 宿主细胞内沙门氏菌细菌数量对STAT3磷酸化的影响

3.3.1 SopB/SopE2对STAT3磷酸化的影响

3.3.2 pcDNA3-FLAG-TRAF6表达载体构建

3.3.3 TRAF6自泛素化与STAT3磷酸化的相关性

第四章 讨 论

第五章 总结与展望

参考文献

发表论文及参加科研情况说明

致谢