骨髓间充质干细胞激活Notch信号通路促进脑缺血后内源性神经干细胞增殖的研究

摘要

目的： 缺血性脑卒中是严重危害人类生命健康的难治性疾病。缺血后大量神经细胞变性坏死，损伤脑组织主要由胶质瘢痕代替，同时遗留神经功能障碍。到目前为止，缺血性脑卒中后的组织修复与功能重建一直是临床治疗中尚未解决的难题。成体哺乳动物脑内神经干细胞（neural stem cells，NSC）的发现为中枢神经系统（central nervous system，CNS）疾病的治疗带来了新的曙光。近年来发现在缺血性脑卒中后移植骨髓基质细胞（bone-derived mesenchymal stem cells，BMSC）可明显促进内源性NSC增殖，并改善神经功能缺损。然而BMSC促进NSC增殖的机制尚不完全清楚。研究表明，Notch信号通路对胚胎期以及成体哺乳动物CNS内NSC的增殖分化起着重要的调控作用。我们在前期的体外实验中也发现BMSC可通过调节Notch信号通路而促进NSC的增殖。因此，我们推测在缺血性脑损伤后移植BMSC很有可能是通过Notch信号通路的作用而促进内源性NSC增殖。本实验拟在前期实验的基础上，通过观察移植BMSC后缺血侧室管膜下区（Subventricularzone，SVZ）的内源性NSC增殖以及其内Notch1、Hes1、Mash1基因表达情况，探讨BMSC移植促进脑缺血后内源性NSC增殖的信号调控机制，为将来利用内源性NSC修复脑缺血等中枢神经系统损伤提供理论依据。 方法： 1、采用贴壁筛选法分离培养大鼠BMSC，取第四代细胞在免疫细胞化学染色检测CD29、CD34鉴定，以备进行细胞移植。 2、局灶性脑缺血模型的制备及实验分组：采用线栓法制作大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）脑缺血模型，于缺血后24h对脑组织进行2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl-2h-tetrazolium chloride，TTC）染色鉴定模型是否成功。实验分BMSC移植组、单纯缺血组和正常组：BMSC移植组大鼠于缺血24h后经股静脉注入经CM-Dil标记的BMSC；单纯缺血组大鼠经股静脉注射等体积的PBS。取移植后第1、3和7天分批处死各实验组大鼠，留取脑组织标本待检。 3、荧光显微镜下观察移植BMSC在缺血侧和健侧脑组织的分布并计数。 4、采用免疫荧光细胞染色检测各实验组缺血侧SVZ内Ki-67、Nestin以及Notch1的表达，并进行阳性细胞计数。 5、采用RT-PCR方法检测各实验组缺血侧SVZ脑组织内Notch1、Hes1、Mashl的mRNA表达水平 结果： 1、原代BMSC分离培养3天后细胞呈短梭形或多角形，呈集落样生长，具有较强折光性。10～14d细胞铺满瓶底达到融合状态，根据细胞生长融合情况5～7天进行传代培养。取第四代BMSC，通过免疫细胞化学染色进行鉴定，结果显示大部分细胞CD29呈阳性表达，CD34为阴性，符合BMSC特征。 2、神经功能Longa评分为1～3分的MCAO模型在缺血24h后，TTC染色后的缺血侧的缺血区大脑皮层与部分纹状体区明显呈白色，正常脑组织染色呈粉红色。 3、BMSC移植1天后，可见经移植的BMSC主要分布在患侧梗塞区周围（7.96±1.284，n=5），健侧脑组织中仅见少数BMSC（3.07±0.77，n=5）（P<0.05）；移植7天后仍可见大量CM-DiⅠ标记的BMSC在缺血区散在分布（7.44±1.58，n=5）。 4、BMSC移植组缺血侧SVZ区第1、3、7天的Ki-67+细胞数分别为13.28±1.501、25.28±1.418、31.4±1.960；单纯缺血组缺血侧SVZ内第1、3、7天的Ki-67+细胞数分别为8.32±0.610、14.32±1.425、27.12±1.724；正常组SVZ内的Ki-67+细胞为5.56±0.713。BMSC移植组各时间点Ki-67+细胞数均明显多于同时间点单纯缺血组和正常组（P<0.05），结果表明BMSC移植后可明显促进缺血侧SVZ区细胞的增殖 5、BMSC移植组缺血侧SVZ区第1、3、7天的Nestin+细胞数分别为11.52±0.879、23.68±1.197、28.56±1.466；单纯缺血组缺血侧SVZ区第1、3、7天的Nestin+细胞数分别为7.36±0.699、13.68±1.137、21.68±1.308；正常组SVZ内的Nestin+细胞数为4.08±0.303。BMSC移植组各时间点Nestin+细胞数均明显多于单纯缺血组相应时间点和正常组（P<0.05），结果表明BMSC移植可明显促进缺血侧SVZ区NSC的增殖。 6、BMSC移植组缺血侧SVZ区第1、3、7天的Notch1+细胞数分别为：12.04±1.763、28.6±1.086、32.2±3.181；单纯缺血组缺血侧SVZ内第1、3、7天的Notch1+细胞数分别为：8.72±0.482、15.76±1.090、27.34±1.760；正常组SVZ内的Notch1+细胞数为：7.32±0.415。BMSC移植组各时间点Notch1+细胞数均明显多于单纯缺血组相应时间点以及正常组（P<0.05），结果表明BMSC移植可明显促进缺血侧SVZ区Notch1的表达 7、BMSC移植组中各时间点的缺血侧SVZ内Notch1 mRNA表达水平较单纯缺血组相应时间点以及正常组均有明显增高（P<0.05）。与正常组比较，单纯缺血组中Notch1 mRNA首先出现下降，随后逐渐升高，第7天Notch1 mRNA表达水平明显高于正常组（P<0.05）；而在BMSC移植后的第1天Notch1 mRNA表达水平即出现明显升高，此后表达虽有波动，但一直维持在高水平。结果表明BMSC移植可明显促进脑缺血后SVZ内Notch1 mRNA的表达。 8、与正常组比较，单纯缺血组第1天时Hes1 mRNA表达出现明显升高，并随后逐渐升高；BMSC移植组各时间点Hes1 mRNA的表达明显高于单纯缺血组相应时间点及正常组（P<0.05）。结果表明BMSC移植可明显促进脑缺血后SVZ内Hes1 mRNA的表达。 9、正常组Mash1 mRNA呈低水平表达；单纯缺血组各时间点SVZ内Mash1 mRNA表达均较正常组明显升高（P<0.05）；BMSC移植组各时间点Mash1 mRNA表达较正常组均有明显升高（P<0.01）；BMSC移植组第1、3天时Mash1 mRNA表达单纯缺血组相应时间点有明显升高（P<0.05），然而在BMSC移植组第7天时Mash1 mRNA表达单纯缺血组第7天时明显降低（P<0.05）。结果表明BMSC可调控脑缺血后SVZ内Mash1 mRNA的表达。 结论： 移植BMSC可通过影响Notch信号通路，促进缺血侧SVZ内Notch1蛋白和Notch1、Hes1、Mash1 mRNA表达增多，从而促进内源性NSC增殖。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩写词表

声明

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3统计学处理

第3章 结果

3.1骨髓间充质干细胞(BMSC)形态学观察及鉴定

3.2 MCAO模型的鉴定

3.3移植BMSC在脑组织内的分布

3.4 BMSC移植对内源性NSC增殖的影响

3.5 BMSC对缺血侧SVZ区Notchl表达的影响

3.6 BMSC对SVZ区脑组织Notch1、Hes1、Mash1的mRNA表达的影响

第4章 讨论

4.1缺血性脑卒中

4.2干细胞

4.3 NSC

4.4 NSC与缺血性脑卒中

4.5 BMSC

4.6 Notch信号通路

4.7 Notch信号通路对NSC增殖分化的调控

4.8 BMSC移植促进内源性NSC增殖分化的机制

第5章结论

致谢

参考文献

附录A图片

附录B 综述:Has因子调节NSC增殖分化的研究进展

攻读学位期间的研究成果