重组人p53腺病毒注射液联合放射治疗对人淋巴瘤疗效的实验研究

摘要

目的： 采用重组人p53腺病毒注射液（recombinant adenovirus encoding human p53tumor suppressor gene，rAd—p53注射液，商品名今又生）联合放射治疗对淋巴瘤进行体外和体内治疗实验，以探讨该药物对淋巴瘤的治疗效果和是否具有辐射增敏性。 方法： 1.设立对照组和实验组，通过流式细胞术观察Raji细胞和Daudi细胞的平均荧光强度，并计算其荧光指数FI（fluorescence index），检测人淋巴瘤细胞株Raji和Daudi的膜表面柯萨奇腺病毒受体（Coxsackie—adenoviral receptor，CAR）和整合素受体（integrin receptors，avβ3、avβ5）的表达。 2.采用四氮唑盐比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）测定按比例稀释成不同浓度的rAd—p53注射液在给药后24、48和72h对人淋巴瘤细胞株Raji和Daudi抑制率，以确定药物的最佳剂量和最佳作用时间点。检测不同照射剂量的放射治疗以及其联合最佳药物剂量对人淋巴瘤细胞株Raji和Daudi抑制率，以确定一个固定的放射治疗剂量。通过倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞的形态学改变和细胞凋亡的形态学特征，来检测rAd—p53注射液对细胞的抑制效果。用流式细胞术检测细胞的周期变化以及细胞凋亡率，用RT—PCR检测细胞的野生型p53基因mRNA的表达变化及其下游基因bcl—2和bax的mRNA表达的改变，用蛋白质的western免疫印迹法（western—blotting）观察细胞内P53蛋白的变化等。通过不同指标比较rAd—p53注射液、不同照射剂量的放射治疗以及两者联合治疗对Raji和Daudi人淋巴瘤细胞的作用效果。 3.建立人淋巴瘤细胞株Raji和Daudi裸鼠移植瘤模型，观察肿瘤生长情况，其中荷Raji细胞裸鼠模型5只，荷Daudi细胞裸鼠模型4只，当肿瘤直径达0.5cm时给予rAd—p53注射液治疗。初步观察rAd—p53注射液的对肿瘤的生长抑制作用和荷瘤鼠的生存期。 结果： 1.Raji细胞和Daudi细胞膜表面的CAR受体和avβ3受体的FI>1，受体为阳性表达，而avβ5的受体为阴性表达，FI<1。 2.MTT检测结果表明，人淋巴瘤细胞株Raji和Daudi的抑制率对rAd—p53注射液具有剂量和时间依赖性，，rAd—p53注射液剂量为2000vp/cell时对细胞的抑制率趋于最大，最佳rAd—p53注射液剂量为2000vp/cell，最佳时间点为48h，达到的最大抑制率分别为（27.5±4.1）%和（28.1±1.6）%；两种细胞对放射治疗也具有剂量依赖性，细胞抑制率随剂量升高；联合治疗为2000vp/cell的rAd—p53注射液剂量和6Gy的照射剂量联合。 3.在倒置显微镜和激光共聚焦显微镜下观察的结果显示，与阴性对照组比较，rAd—p53注射液作用后的人淋巴瘤细胞株Raji和Daudi的细胞形态未见明显变化；放射治疗和联合治疗后，细胞形态较阴性对照组有明显的差别，但放射治疗加与不加rAd—p53注射液差别不明显。 4.流式细胞术检测的细胞周期变化和细胞凋亡率统计结果表明rAd—p53注射液对细胞周期未产生明显的阻滞作用，也未见细胞凋亡率的增加；放射治疗和联合治疗对细胞产生周期阻滞，Raji细胞阻滞于G2—M期，Daudi细胞阻滞于G0—G1期，细胞凋亡率明显增高，分别为（35.6±1.7）%、（37.9±1.3）%和（31.1±2.4）%、（31.5±2.0）%，但两株细胞的放射治疗和联合治疗的凋亡率比较未见明显差异（P≥0.05）。 5. RT—PCR反应结果显示，rAd—p53注射液和放射治疗、联合治疗均使野生型p53基因及bax基因的mRNA的表达均较阴性对照组有所增强；Raji细胞bcl—2基因的mRNA表达未见明显改变，Daudi细胞bcl—2基因为阴性表达。Western—blotting检测结果显示，rAd—p53注射液转染和放射治疗、联合治疗后，人淋巴瘤细胞株Raji和Daudi的P53蛋白表达均有所增加。 6.荷人淋巴瘤裸鼠模型在给予药物治疗后，肿瘤体积依然随时间的延长而增大，最终荷瘤模型均死于肿瘤引起的恶液质。荷Raji细胞裸鼠模型最长生存期为37d；荷Daudi细胞裸鼠模型最短生存期为22d。 结论： 1.Raji细胞和Daudi细胞膜表面的CAR受体和avβ3受体表达为阳性，多数学者认为腺病毒载体是可以转染进入Raji细胞和Daudi细胞内。 2.rAd—p53注射液虽然对淋巴瘤细胞株Raji和Daudi可产生一定的抑制作用，并可使野生型p53基因表达增强，并激活其下游抑癌基因bax表达增强，而且外源性P53蛋白的表达也增加，但转染入细胞内的外源性p53基因的功能并没有得到有效的发挥，因此未引起细胞形态和细胞凋亡形态学发生改变，也不能引起细胞周期的阻滞和细胞凋亡率的增加。说明该药物对Raji细胞和Daudi细胞具有一定的转染性，并可引起细胞分子生物学水平的表达，但其抑制肿瘤细胞的功能在Raji细胞和Daudi细胞内还不足以有效表达，对此类肿瘤的治疗效果不明显，同时也论证了该药物在放射治疗淋巴瘤细胞株Raji和Daudi时，未产生明显的辐射增敏性。 3.rAd—p53注射液对Raji细胞接种的肿瘤无明显抑制作用；对Daudi细胞荷瘤鼠的动物实验存在一定的个体差异，可以增加样本量，以进行进一步的研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第一部分 流式细胞术检测人淋巴瘤细胞株Raji和Daudi的膜表面受体

第二部分：重组人p53腺病毒注射液联合放射治疗对人淋巴瘤细胞调节作用的研究

第三部分：重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞株Raji和Daudi裸鼠移植瘤的作用

结论

参考文献

综述 p53基因治疗与放射治疗联合应用于肿瘤的研究

攻读学位期间学术成果

致谢