麋鹿皮肤成纤维细胞的分离培养与细胞周期同步化研究

摘要

本文以麋鹿的耳尖皮肤组织为材料进行皮肤成纤维细胞的分离与培养，对皮肤成纤维细胞进行传代、冷冻保存、解冻复苏和部分生物学特性的鉴定；用不同汇合程度、血清饥饿不同时间以及含羞草酸不同剂量和时间对糜鹿皮肤成纤维细胞进行同步化处理后，用流式细胞仪分析细胞周期同步化的效果，丰富麋鹿研究的内容。为组织工程研究提供借鉴资料，为麋鹿的基础研究和保护濒危珍稀动物资源提供基础资料。研究结果如下： 1 麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离与体外培养 本试验采用组织块法进行原代培养，获得麋鹿成纤维细胞，并经过反复传代得以纯化。对细胞进行常规冷冻保存，得到麋鹿皮肤成纤维细胞系．F4代生长曲线中，第5 d群体倍增值为5.50，群体倍增时间为39.03 h，第6 d细胞生长减慢；由分裂曲线看出，分裂指数最高时期是在培养的第5 d，第6 d急剧下降,细胞生长曲线与分裂指数表明，麋鹿皮肤成纤维细胞在体外培养条件下存在早期生长延缓和晚期生长抑制，属于正常的体细胞。麋鹿染色体教目为2n=68，核型式为2(M)＋64(A)，XY(A，M)。血清浓度对细胞的生长有影响，10％和15％NCS组有明显的对数生长期，但在对数生长期末凋亡和死亡的细胞数较多，20％NCS组没有明显的对数生长期，并且细胞数目少于10％和15％NCS组，因此细胞培养过程中采用10％NCS，每3 d换一次液，在发生密度抑制和接触抑制前就进行传代，避免营养枯竭和代谢物积累。细胞冷冻时采用10％DMSO作冷冻保护剂，冷冻时先在4℃放置30 min，移入-20℃放置1.5 h，再在液氮面上方悬吊7～8 h后投入液氮，复苏后可获得87.78％的贴壁率。 2 麋鹿皮肤成纤维细胞的细胞周期同步化研究：为了了解麋鹿细胞周期调控的特点，本试验对麋鹿皮肤成纤维细胞进行不同汇合程度、血清饥饿不同时间以及含羞草酸(mimosine)不同剂量和时间的处理，利用流式细胞仪分析细胞周期。结果表明，100％汇合1d的细胞GO/Gl期比例可达91.95％，但是汇合2d后继续培养会导致DNA片段化和细胞的异常聚集。血清饥饿能够迅速地改变麋鹿皮肤成纤维细胞的细胞周期状态，使GO/G1期细胞比例升高，G2/M期细胞比例降低，血清饥饿处理24h后有89.42％的细胞处于GO/GL期,当处理时间超过144h后细胞凋亡和异常聚集的比例会增加。适宜剂量的含羞草酸能够使麋鹿成纤维细胞达到同步化的目的，但效果低于接触抑制和血清饥饿,并且也会对细胞造成损伤。 本研究的创新之处在于丰富了麋鹿研究的基础资料。麋鹿有“活化石”之称，但目前对麋鹿的基础研究在许多方面仍是空白，本试验建立麇鹿皮肤成纤维细胞有限细胞系，研究了麋鹿的部分生物学特性和细胞周期向步化特点，为以后的研究提供方法。

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文摘

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文献综述部分 第一章细胞培养的研究进展及其在濒危动物保护中的应用

文献综述部分 第二章细胞周期的调控及在核移植研究中的应用

试验研究部分 第三章麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离与体外培养

试验研究部分 第四章麋鹿皮肤成纤维细胞的细胞周期同步化研究

致谢

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