小麦隐花色素基因及线粒体ATP合酶Fd亚基基因的克隆与分析

摘要

隐花色素是植物的一类重要蓝光受体，它通常由一个小的基因家族编码。在本研究中，通过综合运用简并引物PCR、Southern杂交和生物信息学方法，揭示了小麦CRY基因家族的组成为CRY1a，CRY1b，CRY2和CRY-DASH，这四个成员在亚基因组水平都是单拷贝基因。小麦、大麦和水稻的CRY1a，CRY1b和CRY2基因分别位于共线性的染色体上。 利用RT-PCR和LD-PCR克隆了Ta CRY1a和Ta CRY2的全长cDNA及其编码基因。比较小麦和其他单、双子叶植物CRY基因的结构表明不同植物的CRY1和CRY2总体上都具有类似的外显子/内含子结构。CRY亚家族的分化在单、双子叶植物产生之前就已发生，单子叶植物的CRY1又进一步分化为CRY1a和CRY1b。 Ta CRY1a和Ta CRY1b在叶片中表达丰度较高，在其他组织中均较低。Ta CRY2在叶片中的表达比Ta CRY1低，但在萌动胚的表达显著比Ta CRY1高。白光和蓝光照射对幼叶中Ta CRY1a和Ta CRY2的表达都有一定的上调作用，红光对Ta CRY1a表达的上调作用明显。在幼根和叶中Ta CRY1a的表达不受NaCl，PEG和ABA处理的影响；但TaCRY2在幼根和萌动胚中的表达受这三种胁迫的显著诱导。EST库检索发现白粉菌侵染和长时间的低温处理能分别增加叶片中TaCRY2和TaCRY1a的表达频率。 TaCRY1a一级结构不含任何已知的核定位和核输出信号，但瞬时表达实验表明它是一个蓝光依赖的核质穿梭蛋白。TaCRY1a的N端(AA1-AA492)和C端(AA493-AA700)分别有至少两个和一个区段包含核定位信息。核输出信息仅存在于分子的N端。N端AA136-AA260区段同时具有足够的核定位和核输出信息。 线粒体ATP合酶(F0F1-ATPsynthase)是细胞能量代谢的关键酶。本研究从小麦T-型细胞质雄性不育恢复系N2114的花药中克隆了编码F0F1-ATPsynthase FAd亚基的基因TaFAd，并证明其编码产物定位于线粒体。该基因在亚基因组水平为单拷贝。 TaFAd在小麦叶、茎、花药、雌蕊等各组织中均有表达，但其在T-CMS花药中的表达丰度显著低于可育花药。Western杂交检测不到不育花药中TaFAd蛋白的积累。TaFAd在太谷核不育小麦花药中的表达正常，其丰度与可育亲本扬麦5号无明显差异。这些结果表明T-CMS花药中TaFAd的表达受到线粒体的反向调控。编码F0F1-ATP合酶20kDa亚基的基因表现出与TaFAd类似的在T-CMS花药中显著降低的表达模式。编码γ亚基和6kDa亚基基因的表达在可育与不育花药间无明显差异。 TaFAd与Rf6同位于与小伞山羊草6U染色体同源的小麦第六群染色体短臂上。通过对N2114，Su3，CS和小伞山羊草上TaFAd位点的克隆和序列比较，我们证明N2114中含有一个易位自小伞山羊草的AuFAd基因。根据该基因序列设计的STS标记在N2114×Su3 F2群体中与育性共分离。该标记可用于以N2114为基础的恢复系选育。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略词表

个人简介

致谢

第一章文献综述

第一节高等植物隐花色素作用的分子机制

一、 高等植物隐花色素及其功能

二、 隐花色素的亚细胞定位

三、 CRY激活的机制

四、 CRY的下游信号转导

五、 隐花色素信号的调控机制

展望

第二节 线粒体FoFl-ATP合酶及其与CMS的关系

一、 线粒体FoFl-ATP合酶的分布和亚基组成

二、 线粒体FoFl-ATP合酶与CMS的关系

结语

第二章 小麦隐花色素基因家族的组成分析

引言

材料与方法

一、植物材料

二、DNA提取和简并引物PCR

三、PCR产物的克隆和序列分析

四、Southem杂交

五、生物信息学分析

六、缺体-四体定位

结果与分析

一、小麦CRY家族基因的鉴定

二、CRY1a，CRY1b和CRY2是单拷贝基因

三、 CRY1a，CRY1b和CRY2在单子叶植物中的染色体位置共线性

讨论

第三章TaCRYla和TaCRY2基因的克隆及其表达分析

引言

材料与方法

一、 植物材料与处理方法

二、DNA，RNA的提取和反转录

三、RT-PCR，LD-PCR和克隆

四、半定量RT-PCR

五、 EST频率计算

结果与分析

一、 TaCRY1a和TaCRY2a的克隆

二、CRY1a和CRY2基因及其蛋白结构的物种间比较

三、TaCRY基因的表达分析

讨论

第四章 TaCRY1a蛋白核输入和核输出决定区段的研究

引言

材料与方法

一、 实验材料

二、 瞬时表达载体的构建与转化

三、转化方法

结果与分析

一、TaCRY1a-GFP具有蓝光依赖的核质穿梭特性

二、TaCRY1a的N端和C端都具有核定位信息

三、TaCTYla N端的AA136-260AA区段具足够的核定位和核输出信息

讨论

第五章小麦FoFl-ATP合酶亚基基因TaFAd的克隆及其表达研究　

引言

材料与方法

一、植物材料

二、DNA,RNA提取和反转录

三、生物信息学分析，RT-PCR和克隆

四、Southern杂交

五、缺体-四体定位

六、 瞬时表达载体的构建、转化和共聚焦显微镜观察

七、半定量RT-PCR

八、His-TaFAd融合蛋白的原核表达

九、多克隆抗体制备

十、Western杂交

结果与分析

一、TaFAd全长cDNA的克隆和鉴定

二、TaFAd定位于第六部分同源群短臂

三、TaFAd的表达分析

四、 ATP合酶γ，6kDa，20kDa亚基基因在T-CMS系和可育花药中的表达分析

讨论

第六章 TaFad与T型育性恢复基因的连锁关系研究

引言

材料与方法

一、植物材料

二、DNA,DNA提取和反转录

三、PCR和克隆

结果与分析

一、N2114的6U易位片段包含一个小伞山羊草FAd基因

二、AuFAd与Rf6共分离

讨论

参考文献

全文总结

全文创新点

发表论文情况

附表