鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因核酸疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫效力观察

摘要

鸡传染性喉气管炎(ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性上呼吸道传染病，呈全球性流行，是危害养禽业的重要疫病之一。目前国内外防制本病普遍采用弱毒疫苗。这些疫苗的毒力普遍偏强，可以在鸡体内潜伏感染，而且在鸡体传代过程中毒力返强。因此，研制更安全而有效的疫苗，将有利于彻底控制乃至根除ILT。DNA疫苗作为第3代疫苗，因其既有亚单位疫苗的安全性，又有减毒活疫苗的有效性而受到研究人员的瞩目。但是DNA疫苗诱导机体产生的抗体水平低，还不能完全有效抵抗致死剂量病原体的攻击，因此，本研究采用PCR技术从河南省分离的ILTV HN1株DNA中扩增gB基因，构建gB基因重组真核表达质粒，并将其与鸡IL-18基因重组真核表达质粒联合免疫SPF鸡，探索ILLTV HN1株gB基因的免疫原性以及鸡IL-18的免疫增强作用，以期为更好地防制ILT提供新的思路。研究内容如下： 1.根据已发表的ILTV SA2疫苗株gB基因序列(M64927)设计、合成了1对引物，以ILTV HN1株基因组DNA为模板，从河南省分离的ILTV HN1株DNA中扩增gB基因，并进行克隆和测序。结果表明，获得了ILTV HN1株gB基，全长为2629 bp，包含一个完整的开放阅读框，共编码873个氨基酸的多肽，推导氨基酸序列有8个潜在的N-糖基化位点，有12个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明，ILTV HN1株gB基因与GenBank中读取的澳大利亚SA2疫苗株、辽宁疫苗株、烟台株、美国632强毒株、英国Throne强毒株gB基因核苷酸序列同源性为99％以上，与ILTV-SA2株gB基因比较发现，ILTV HNl株gB基因核苷酸序列在第89位均缺失1个碱基G，而在第102位又都插入1个碱基A，从而引起该毒株gB基因推导的氨基酸序列中第28～32位5个氨基酸的移码突变。 2.根据真核表达载体pcDNA3.1(+)和ILTV gB全基因核苷酸序列，设计，合成1对引物，PCR扩增ILTV gB全基因。将EcoR I和Xho I酶切获得的gB基-因片段克隆到经同样处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/gB(简称pgB)。将pgB质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，RT-PCR表明转染细胞中含gB基因的mRNA，间接免疫荧光检测表明目的蛋白在CEF中得到了表达。 3.通过RT-PCR技术，无需用非特异性免疫原如ConA、PHA等刺激分离的脾淋巴细胞，直接从罗曼鸡脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增鸡IL-18全基因，并克隆和测序。结果表明，鸡IL-18基因全长为597 bp。与GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现，罗曼鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致。将该基因片段重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL-18(简称pIL-18)。经EcoR I和Xho I双酶切、PCR扩增和基因测序，证实鸡IL-18全基因被正确重组到pcDNA3.1(+)真核表达质粒上；将pIL-18质粒转染Cos7细胞，转染细胞中含鸡IL-18基因的mRNA，表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。 4.为了检测这2个质粒是否可以诱导动物机体产生特异性免疫，分别用这2个重组质粒和载体质粒pcDNA3.1(+)以及减毒疫苗免疫接种21日龄SPF鸡，免疫分组：(A)pgB，(B) pIL-18，(C)pgB和pIL-18，(D)减毒疫苗和pIL-18，(E)减毒疫苗，(F)pcDNA3.1(+)，(G) Control。免疫2次，间隔为2周，每次每只鸡的免疫剂量为100μg。以MTT法检测鸡外周血淋巴细胞经丝分裂原ConA刺激后的增殖反应活性，Real-time PCR检测细胞因子IFN-γ和IL-2的表达水平、流式细胞术检测外周血CD4+T、CD8+T和TCR+T细胞的变化及间接ELISA法检测血清抗体水平。结果表明，ILTV gB因免疫诱导机体产生了较强的淋巴细胞增殖反应，免疫组外周血中CD4+T、CD8+T和TCR+T细胞明显高于对照组，含IL-18基因的两组(C和D)诱导了高水平的IFN-γ和IL-2表达，载体质粒和空白对照组没有变化，血清抗体在免疫后第2周发生阳转，而对照组无相应变化。这是ILTV基因gB基-因和鸡IL-18基因免疫研究的首次报道。第2次免疫后3周，所有鸡以ILTVHN1株强毒0.4 mL进行攻毒。攻毒后，非免疫鸡全部发病，并在第2天出现死亡，免疫组部分发病，ILTV HN1株gB基因单独或与鸡IL-18基因联合免疫的保护率分别为79％、86％，而对照组仅为7％。这表明ILTV HN1株gB基因和鸡IL-18基因联合免疫提供了较强的免疫保护，这为ILTV的防制开辟了新的途径。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号及缩略语说明

声明

引言

第一篇文献综述

第一章鸡传染性喉气管炎病毒研究进展

1.1病原学

1.2分子生物学特征

1.3诊断

1.4防制

参考文献

第二章DNA疫苗研究进展

2.1 DNA疫苗的组成

2.2 DNA疫苗的免疫学特性

2.3 DNA疫苗免疫机制及特点

2.4影响基因免疫效果的因素

2.5基因免疫试验研究

2.6应用前景

参考文献

第三章白细胞介素-18的研究进展

3.1IL-18的发现

3.2IL-18的产生及分布

3.3IL-18的分子结构特点

3.4IL-18受体及信号传递

3.5IL-18的功能

3.6 IL-18的生物活性

3.7 IL-18的应用前景

3.8鸡IL-18的研究概况

参考文献

第二篇试验研究

第四章鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因的克隆与序列分析

摘要

引言

4.1材料与方法

4.2结果与分析

1.3讨论

参考文献

第五章鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因真核表达载体的构建及表达

摘要

引言

5.1材料和方法

5.2结果与分析

5.3讨论

参考文献

第六章鸡白细胞介素18基因的扩增、克隆及其真核表达载体的构建

摘要

引言

6.1材料和方法

6.2结果与分析

6.3讨论

参考文献

第七章鸡传染性喉气管炎病毒gB基因和鸡IL-18基因免疫学试验

摘要

引言

7.1材料与方法

7.2结果与分析

7.3讨论

参考文献

第八章鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因核酸苗与鸡IL-18联合免疫攻毒保护试验

摘要

引言

8.1材料与方法

8.2结果与分析

8.3 讨论

参考文献

全文总结

致 谢

攻读博士学位期间发表的论文