小鼠睾丸生精细胞凋亡相关新基因mTSARG3及人类同源基因TSARG6的克隆及初步功能研究

摘要

人类睾丸是一种具有高度增殖能力的组织,但成年睾丸中产生的成熟精子的数量要比预计生成的精子数少20-75％.大量研究表明睾丸中生精细胞这种自发性退化是通过凋亡而发生的.凋亡除在正常精子发生中自发进行外,还可以被多种调节性信号诱发产生,其中热压是诱导凋亡的一个重要因素.凋亡调控的紊乱是特发性男性不育症的一个重要决定因素.克隆新的生精细胞凋亡相关基因,深入了解生殖细胞凋亡的调控机制,明确外界死亡信号触发生殖细胞凋亡的信号传递通路以及各通路之间的相互联系,将有助于阐明人类雄性不育的分子机制,为治疗男性不育症及开发新的避孕药物提供理论依据.本室姜宏等通过建立小鼠隐睾模型,运用抑制消减杂交法(SSH)克隆出24个小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因的EST,并在GenBank中登录.该研究利用genescan技术和PCR等实验方法,从上述EST中的BE644537出发,成功地克隆了小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mTSARG3和人类同源基因TSARG6,并对其进行了初步的功能研究.

目录

文摘

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实验技术路线图

前言

第一章 mTSARG3基因的克隆与生物信息学分析

1材料和方法

1.1材料与试剂

1.2主要仪器

1.3新基因序列分析

1.4设计PCR引物以扩增mTSARG3阅读框全长

1.5 mTSARG3完整编码区的cDNA克隆

1.6大肠杆菌感受态的制备

1.7 mTSARG3阅读框全长PCR产物连接转化

1.8阳性克隆的确定

1.9新基因序列的生物信息学分析

1.10 PUCm-T/mTSARG3质粒DNA的提取

1.11 Northern杂交检测mTSARG3基因的组织表达谱

2结果

2.1新基因序列分析

2.2含mTSARG3完整编码区的cDNA克隆

2.3MTSARG3基因序列和蛋白质结构生物信息学分析

2.4 Northern杂交

3讨论

3.1克隆策略

3.2 mTSARG3基因及其编码蛋白的特性分析

第二章 mTSARG3基因功能的初步研究

1材料与方法

1.1实验动物

1.2 mTSARG3阅读框全长片断的获得

1.3 pGEX-Kg载体

1.4 PQE30载体

1.5 pEGFP-C3载体

1.6酶及主要试剂

1.7 mTSARG3基因PCR引物及原位杂交探针

1.8主要仪器

1.9小鼠多种组织的RNA抽提

1.10多组织RT-PCR检测mTSARG3基因组织表达谱

1.11小鼠多种组织的RNA逆转录合成cDNA第一链

1.12不同发育时期小鼠睾丸组织RT-PCR扩增mTSARG3阅读框片断

1.13不同发育时期小鼠睾丸组织切片原位杂交检测mTSARG3基因表达

1.14实验性小鼠隐睾模型的建立

1.15不同天数小鼠隐睾模型睾丸组织RT-PCR检测mTSARG3和Hsp70-1基因表达

1.16不同天数小鼠隐睾模型睾丸睾丸组织切片原位杂交检测mTSARG3基因表达

1.17不同天数小鼠隐睾模型睾丸睾丸组织切片免疫组化检测mTSARG3蛋白表达

1.18 mTSARG3基因的Southern杂交

1.19含有mTSARG3基因及含有载体质粒的小量抽提

1.20胶回收mTSARG3基因及载体酶切片断

1.21 pGEX-KG/mTSARG3融合质粒的原核表达研究

1.22 PQE/mTSARG3融合质粒的原核表达研究

1.23 mTSARG3蛋白的亚细胞定位及对细胞生长周期的影响

2结果

2.1多组织RT-PCR检测mTSARG3组织表达谱

2.2不同发育时期小鼠睾丸组织RT-PCR

2.3不同发育时期小鼠睾丸组织切片原位杂交

2.4不同天数小鼠隐睾模型睾丸组织RT-PCR

2.5不同天数小鼠隐睾模型睾丸睾丸组织切片原位杂交

2.6不同天数小鼠隐睾模型睾丸睾丸组织切片免疫组化

2.7 Southern杂交

2.8 pGEX-KG/mTSARG3融合质粒的原核表达研究

2.9 PQE/mTSARG3融合质粒的原核表达研究

2.10 mTSARG3蛋白的亚细胞定位及对细胞生长周期的影响

3讨论

第三章 TSARG6基因的克隆与生物信息学分析

1材料和方法

1.1材料与试剂

1.2主要仪器

1.3新基因序列分析

1.4设计PCR引物以扩增TSARG6阅读框全长

1.5 TSARG6完整编码区的cDNA克隆

1.6基因序列和蛋白结构分析

1.7 Northern杂交检测TSARG6多组织表达谱

2结果

2.1新基因序列分析

2.2 TSARG6完整编码区的cDNA克隆

2.3基因序列和蛋白质结构生物信息学分析

2.4 Northern杂交

3 讨论

第四章 TSARG6基因功能的初步研究

1材料与方法

1.1目的基因

1.2 pGEX-Kg载体

1.3 pEGFP-C3载体

1.4酶及主要试剂

1.5引物和原位杂交用寡核苷酸探针

1.6主要仪器

1.7抽提人类组织RNA逆转录合成cDNA第一链

1.8人类多组织RT-PCR检测TSARG6多组织表达谱

1.9人类精子RT-PCR扩增TSARG6阅读框片断

1.10不同发育时期人睾丸组织RT-PCR扩增TSARG6阅读框片断

1.11人睾丸组织原位杂交检测TSARG6表达

1.12兔抗TSARG6/mTSARG3抗体的制备

1.13人睾丸组织免疫组化检测TSARG6蛋白表达

1.14 pGEX-KG/TSARG6融合质粒的原核表达研究

1.15 TSARG6蛋白的亚细胞定位

2结果

2.1多组织RT-PCR

2.2人精子RT-PCR

2.3不同发育时期人睾丸组织RT-PCR

2.4原位杂交

2.5免疫组化

2.6 pGEX-KG/TSARG6融合质粒的原核表达研究

2.7 TSARG6蛋白的亚细胞定位

3讨论

小结

参考文献

综述

致谢

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