华癸中生根瘤菌内源质粒间的相互作用及其对共生固氮的影响

摘要

从华中农业大学水稻田采集的紫云英根瘤中分离到62株华癸中生根瘤菌，经培养观察、显微观察和回接实验确认其中57株为典型的华癸中生根瘤菌。供试菌株的最早现瘤时间为8d，最迟超过30d，多数菌株为10-22d。对其中的44株质粒的检测结果表明：13株含3个质粒、21株含2个质粒、7株含1个质粒、3株不含质粒，大小范围为150-428kb。 采用Tn5-mob-sacB转座子对含有的3个大质粒的HN3015菌株进行定向标记，获得各供试质粒的标记菌株。利用sacB基因对蔗糖的敏感性进行标记质粒消除实验，获得HN3015的质粒消除或缺失突变株，其中HN3015-1为第一大质粒pMhHN3015c消除突变株，HN3015-2为为第二大质粒pMhHN3015b消除突变株，HN3015-3为第三大质粒pMhHN3015a消除突变株，HN3015-6为pMhHN3015a部分缺失突变株。对HN3015与突变株的培养特征、生长速度和共生结瘤能力进行的研究结果表明：质粒消除或缺失突变株的培养特征均与出发菌株一致，第一大质粒pMhHN3015c与固氮有关，第二大质粒pMhHN3015b的消除则失去结瘤能力，第三大质粒pMhHN3015a的消除或缺失不但未影响结瘤与固氮能力，其消除反而可增强突变株HN3015-3的竞争结瘤能力和共生效率。抗酸性实验结果表明3个内源质粒均对HN3015的抗酸性有正控制作用，并对其抗碱性起负控制作用。生长实验结果表明：3个内源质粒亦对生长速率有负控制作用。 将pMhHN3015c：：Tn5-mob-sacB从供体菌HN3015T18导入受体菌HN308SR后，受体菌的第一大质粒pMhHN308c被消除，表明pMhHN3015c与pMhHN308c不相容，应归于同一不相容群。在对转移接合子HN308SRNl8进行质粒消除时，发现其内源小质粒pMhHN308a与pMhHN3015c：：Tn5-mob-sacB同时消除，获得了仅含pMhHN308b的质粒消除突变株HN308SRN18D。盆栽结瘤试验结果表明：转移接合子HN308SRN18只能在紫云英上形成无效根瘤，证明其内源大质粒pMhHN308c与固氮有关，且不能为导入大质粒pMhHN3015c取代。质粒消除突变株HN308SRNl8D依然保持结瘤能力的结果表明pMhHN308b与结瘤有关。 将HN3015的另一标记小质粒pMhHN3015a：：Tn5-mob-sacB导入HN308SR时，发现受体菌的第二大质粒被消除，显然pMhHN3015a与pMhHN308b不相容，应属于同一不相容群，并与HN308SR的pMhHN308a和pMhHN308c属于不同的不相容群。但转移接合子HN308SRN29的质粒消除实验未获得质粒消除突变株。pMhHN3015a和pMhHN308a的大小相近，仅凭凝胶电泳位置难于区分。盆栽结瘤试验结果表明：pMhHN308a与HN308的结瘤有关，而含有质粒pMhHN3015a、pMhHN308a和pMhHN308c的转移接合子HN308SRN29却失去了结瘤能力。本结果表明：pMhHN308a可能因与pMhHN3015a发生了重组而丢失了结瘤基因，其Tn5亦可能因转座至染色体而不能获得质粒消除突变株。 用三亲本杂交法将供体菌HN3015的2个标记质粒pMhHN3015a和pMhHN3015c分别导入受体菌7653R-1SR时，发现这2个质粒均可分别与7653R-1SR中的pMh7653Ra共存，它们应属于不同的不相容群。但转移接合子7653R-1SRN29的质粒消除突变株7653R-1SRN29D-B在消除外源质粒的同时却产生了一个新质粒p76H4。但在另一质粒消除突变株7653R-1SRN29D-A中却未发现这个新质粒。盆栽结瘤试验结果表明：7653R-1SRN18只能形成少数无效根瘤，其瘤数与7653R-1SR相近。前面已证实pMhHN3015c与固氮能力有关，但它的导入却未能恢复受体菌7653R-1SR的固氮能力。7653R-1SRN18的质粒消除突变株依然与7653R-1SR-样，只能形成少量无效根瘤。7653R-1SRN29在紫云英根上亦形成无效根瘤，但瘤数接近7653R。前面已证实pMhHN3015a能抑制HN3015的共生效应，但本研究将它导入7653R-1SR时却反而提高了转移接合子的结瘤能力。7653R-1SRN29的质粒消除突变株7653R-1SRN29D-A也只能形成少量无效根瘤，但另一质粒消除突变株7653R-1SRN29D-B却完全丧失了结瘤能力。 将7653R的共生质粒pMh7653Rb导入受体菌HN308SR时，发现受体菌的两个稳定内源质粒pMhHN308b和pMhHN308c随着外源质粒pMh7653Rb的导入而同时被消除。盆栽结瘤试验结果表明：pMhHN308b与结瘤相关，由于pMh7653Rb的导入能维持HN308SRN14的结瘤能力，其瘤数也超过HN308SR，但不能替代pMhHN308b和pMhHN308c。质粒消除突变株HN308SRNl4D只形成少量无效根瘤，确认pMhHN308a与HN308的结瘤能力有关。 用三亲杂交法将7653R的共生质粒pMh7653Rb导入HN3015SR时发现所获转移接合子：HN3015SRN14的第二大质粒为pMhHN7653Rb，受体菌HN3015SR的第二大质粒则由于外源质粒的不相容性而被消除。HN3015SRN14的质粒消除实验获得了消除第二大质粒的HN3015质粒消除突变株(仅含pMhHN3015a和pMhHN3015c)。盆栽结瘤试验结果表明：转移接合子HN3015SRN14只能形成无效根瘤，其标记质粒消除突变株HN3015SRN14D则完全失去结瘤能力。 采用通用引物RC1和RC3对6个供试转移接合子及其质粒消除突变株进行repC基因的.PCR扩增结果表明：除质粒消除突变株7653R-1SRN18D和7653R-1SRN29D未能扩出repC基因外，其它供试菌株均扩出了750bp左右的repC序列。对所有供试10个菌株的repC序列测定与同源性比较结果表明：供试华癸中生根瘤菌株的repC序列高度相似(99％)，但与其它根瘤菌的repC基因有明显差异。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1根瘤菌内源质粒的研究进展

1.1.1共生质粒的功能

1.1.2非共生质粒的功能

1.1.3根瘤菌质粒的多样性

1.1.4根瘤菌质粒的转移性、稳定性和复制

1.1.5根瘤菌质粒相互作用

1.1.6根瘤菌质粒的消除方法

1.2华癸中生根瘤菌的研究进展

1.2.1华癸中生根瘤菌的遗传多样性

1.2.2华癸中生根瘤菌的质粒多样性

1.2.3华癸中生根瘤菌质粒的功能

1.2.4华癸中生根瘤菌的结瘤因子

1.2.5华癸中生根瘤菌的结瘤基因

1.2.6华癸中生根瘤菌的胞外多糖

1.2.7华癸中生根瘤菌的生理生化

1.2.8插入顺序、nifA、opa22基因鉴定和外源基因表达

1.3本研究的目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.1.1供试的菌株和质粒

2.1.2供试植株品种及来源

2.1.3培养基与培养条件

2.1.4抗生素与使用浓度

2.1.5缓冲液与试剂

2.2方法

2.2.1根瘤中根瘤菌的分离

2.2.2根瘤中类菌体的观察

2.2.3活菌数测定

2.2.4菌株的纯化

2.2.5植物回接实验

2.2.6根瘤菌质粒的快速检测

2.2.7根瘤菌抗药性自发突变株的筛选

2.2.8带有Tn5-mob-sacB的根瘤菌转座突变株的筛选

2.2.9质粒上带有Tn5-mob-sacB标记菌株的筛选与标记质粒的消除

2.2.10根瘤菌种内内源质粒的诱动转移与转移接合子的质粒消除

2.2.11根瘤菌质粒稳定性的检测

2.2.12根瘤菌生长速度的测定

2.2.13根瘤菌抗酸(碱)性的测定

2.2.14植物盆栽结瘤实验

2.2.15竞争结瘤实验

2.2.16根瘤固氮酶活测定

2.2.17根瘤石蜡切片

2.2.18分子生物学基本操作

2.2.19细菌总DNA提取

2.2.20统计方法

2.2.21生物信息学

3结果与讨论

3.1华癸中生根瘤菌的分离、回接与质粒检测

3.1.1华癸中生根瘤菌的分离

3.1.2植物回接实验

3.1.3根瘤菌质粒的快速检测

3.1.4小结与讨论

3.2华癸中生根瘤菌HN3015的质粒消除及其生物学特征

3.2.1 HN3015质粒的消除

3.2.2 HN3015质粒的生物学特征

3.2.3小结与讨论

3.3标记菌株的筛选与结瘤功能的鉴定

3.3.1抗药性突变株的筛选

3.3.2带有Tn5-mob-sacB的根瘤菌转座突变株的筛选

3.3.3小结与讨论

3.4内源质粒不相容性的测定

3.4.1 HN3015和HN308内源质粒不相容性的测定

3.4.2 HN3015和7653R-1内源质粒不相容性的测定

3.4.3 7653R和HN308、HN3015内源质粒不相容性的测定

3.4.4 7653RT14的pMh7653Rb向HN3015-2SR和HN3015-3SR转移

3.4.5内源质粒在不同菌株组合间诱动转移频率的测定

3.4.6转移接合子的质粒稳定性测定

3.4.7小结与讨论

3.5 Kan基因和repC基因的鉴定

3.5.1 Kan基因的鉴定

3.5.2质粒复制基因repC的鉴定

3.5.3小结与讨论

4总结与展望

4.1已取得的主要研究成果

4.2进一步研究的设想

5参考文献

致谢

附录