一株耐镉恶臭假单胞菌的分离鉴定及其重要的镉抗性相关基因的克隆

摘要

从武汉钢铁厂污泥样本中分离到一株对重金属镉具有高耐受的细菌，通过形态学观察、大量的生理生化实验以及16Sr DNA序列的分析，将该细菌鉴定为恶臭假单胞菌，命名为Pseudomonas putida CD2。金属的最大耐受浓度(MTC)实验显示了菌株CD2对多种二价的重金属离子具有极高的耐受性。 利用转座子 Tn5-B21对菌株CD2进行了随机插入突变，从12000个突变子中筛选获得12个镉离子敏感的突变株。使用inverse PCR方法克隆了突变株中 Tn5-B21的侧翼序列。结果发现有六个基因与重金属镉的耐受有关，他们分别是cadA2、czcC1、czcB1、czcA1、colR 和 colS。其中czcC1、czcB1 和 czcA1 组成了操纵子czcCBA1；colR和colS组成了操纵子colRS。 czcCBA1的缺失严重的影响了P.putida CD2对各种二价重金属离子的耐受能力，尤其是Cd<'2+>、Zn<'2+>和Co<'2+>。其翻译出的三个蛋白组成一个横跨细胞壁的蛋白复合体，形成一个不需要能量的阳离子.质子对流泵，直接将细胞内多余的重金属离子排出胞外。cadA2的缺失仅仅导致对Cd<'2+>、Zn<'2+>和Pb<'2+>的敏感，cadA2 编码一个质膜P型 ATPase，在水解ATP供能的情况下，改变蛋白构像形成离子通道，将金属离子送到胞质空间。czcCBA1 和cadA2的同系物在其他的重金属抗性细菌中已见报道。 colRS是一个典型的组氨酸蛋白激酶信号转导系统，这个系统已被报道与细菌的根际定植能力、细菌的互作、以及内生转座子转座频率等生理反应相关。这里我们发现它控制着重金属的耐受，colRS的缺失导致了对二价重金属离子抗性的下降，特别是Mn<'2+>，这个新的功能通过互补实验得到了验证。 利用Tn5-B21上带有的不含启动子的lacZ基因，可以通过测定β-galactosidase活性来研究这些抗性基因的金属诱导表达差异。Zn<'2+>能85倍的诱导 czcC1的表达，Cu<'2+>对于 czcC1 也是一个好的诱导剂。cadA2 能明显被Cd<'2+>、Zn<'2+>和pb<'2+>诱导。而colR的金属诱导表达不明显。 上述研究结果和结论，对研究细菌对重金属的耐受机制有非常重要的理论意义。

目录

论文说明：缩略语

声明

摘要

1.文献综述

1.1前言

1.2重金属的污染途径及对人类健康的危害

1.3微生物对重金属的耐受机制

1.3.1微生物对重金属的累积

1.3.2重金属的微生物转化

1.3.3金属硫蛋白

1.3.4重金属输出系统

1.4假单胞菌的金属抗性研究进展

1.5双组分信号转导系统简介

1.6本研究的目的与意义

2.材料和方法

2.1材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2培养基

2.1.3试剂和缓冲液

2.1.4抗生素

2.2方法

2.2.1分子生物学常规操作

2.2.2菌株CD2的形态学观察和生理生化鉴定

2.2.3菌株CD2对金属的最大耐受浓度(MTC)的测定

2.2.4假单胞菌总DNA的提取

2.2.5 16S rDNA的序列测定

2.2.6接合实验

2.2.7 Inverse PCR反应

2.2.8 β-Galactosidase的活性测定(MILLER等，1972）

2.2.9核酸及蛋白质序列分析

3.结果与讨论

3.1耐镉细菌CD2的分离鉴定

3.1.1菌株的分离

3.1.2形态学观察

3.1.3生理生化实验

3.1.416S RDNA序列分析

3.1.5抗药性实验

3.1.6 Pseudomonas putida CD2的重金属耐受能力

3.1.7小结与讨论

3.2突变体库的构建及镉敏感突变体的筛选

3.2.1 Tn5-B21插入突变体库的构建

3.2.2镉敏感突变菌株的筛选

3.2.3突变菌株的重金属耐受能力

3.2.4小结与讨论

3.3抗性基因的克隆

3.3.1 Tn5-B21插入失活基因部分片段的PCR扩增

3.3.2 Tn5-B21插入失活基因扩增片段的测序及序列分析

3.3.3小结与讨论

3.4 colRS全基因克隆及互补实验

3.4.1 colRS全基因克隆

3.4.2 colRS核酸序列分析

3.4.3 ColRS蛋白质序列的分析

3.4.4互补实验验证colRS的功能

3.4.5小结与讨论

3.5抗性基因的金属诱导活性

总结和展望

参考文献

博士研究生期间发表论文情况

附录

致谢